분자생물학실험 | 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현, 정제 및 확인

 

 

 

실험 방법

1. 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현

Ampicillin 배지 뒷면에 cell 이름, streaking한 날짜, 본인 이름 등을 써주고 여기에 streaking을 할 Cell stock을 얼음에 가져온다. 팁 끝을 살짝 알코올램프에 대어 주고 식힌 뒤 cell stock을 조금 묻혀 배지에 streaking 한다. 37℃ incubator에 streaking한 LB plate를 뒤집어 넣어 하루간 키운다.

 

그 다음날 plate를 꺼내 inoc㎕ation과정을 거쳐준다. 먼저 Conical tube에 라벨링을 해주고 (LB AMP 50㎖) LB 50㎖에 맞춰 항생제를 50㎍/㎖가 되게 넣고 위 아래로 흔든다. 그리고 유리실험관에 LB를 6㎖씩 분주해 줍니다. (총 4개) 하나의 colony를 따서 inoc㎕ation을 해주고, 각 유리시험관마다 라벨링을 해준다.

 

Shaking incubator에서 37℃, 200rpm, 14시간 키워준다. 2L 삼각 플라스크에 LB 400㎖를 넣고 Ampicillin의 농도가 50㎍/㎖가 되게 넣어준다. 유리시험관에서 cell 4㎖를 취하여 2L 삼각 플라스크에 transfer를 해주고, Shaking incubator에서 다시 키운다. 삼각 플라스크에 들어있는 용액의 값이 0.4～0.6이 될 때까지 30분 마다 측정하기 위해, cuvette에 1㎖를 넣어준다. OD값을 측정할 spectrophotometer 파장을 600으로 설정하고, 기기 안에 cuvette을 넣는다.

 

기계의 화면에 auto zero를 눌러 영점을 맞춘 뒤, 측정을 누른다. 그리고 이 0.4～0.6이 되었을 때 종료한다. 그 이유는 이 때가 Exponential phase여서 미생물이 빠르게 증식하기 때문이다. 그리고 2L의 삼각 플라스크에 IPTG를 1mM이 되도록 넣어준 후, Shaking incubator에서 3시간 더 배양한다.

 

그 다음에 cell down 과정입니다. 200㎖씩 원심분리용 bottle에 나누어 담는다. 이 때 Centrifuge기계에 넣을 때에는 마주보는 bottle이 서로 균형이 맞아야 하므로 더 무게가 많이 나가는 쪽의 용액을 버려 균형을 맞추어 준다. High speed centrifuge의 rotter를 조립하고 무게가 맞는 bottle을 마주보게 하여 넣어준다.

 

(총 4개) 전원을 키고 뚜껑을 닫고 5000rpm 4℃ 15분간 원심분리를 한다. 15분 뒤에 Pellet을 확인한다. 그리고 Bottle의 supernatant는 버리고 Resuspension buffer를 20㎖씩 4개에 넣어주고 Vortexing으로 cell을 푼다. 그리고 50㎖ conical tube에 옮겨준다.

 

각 tube 간의 무게균형을 맞춰주기 위해, 무게가 적은 쪽에 Resuspension buffer를 넣어준다. Conical tube를 4000rpm 4℃ 15분간 원심분리를 한 후 supernatant는 버리고 pellet만 남겨서 -80℃ deep freezer에서 보관한다.

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2. 재조합 단백질 Taq polymerase 정제

Cell disruption을 하기 위해 효소를 이용해서 세포벽을 용해시킬 것이다. 여기에 사용되는 것이 lysozyme과 EDTA이다. Lysozyme이 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸에 있는 N-acetylmuramic acid와 N-acetyl-D-glucosamine 사이의 -1,4-glycosidic bond를 가수분해하기 때문이다.

 

Pre-lysis buffer 40㎖에 Lysozyme을 4㎎/㎖로 만들기 위해 이를 0.16g을 resuspension buffer 30㎖에 넣어 stirrer로 녹인다.

 

<Pre-lysis buffer>

Resuspension buffer 40㎖

Lysozyme 0.16g

최종 양 40㎖

 

그 후 Resuspension buffer 40㎖을 맞춰준다. 전 실험에 냉동보관해둔 cell에 pre-lysis buffer 20㎖을 넣고, Pellet이 풀어지게 vortexing을 한 뒤 room temperature(약 25℃)에서 15분간 보관한다.

 

Lysis buffer 30㎖을 비커에 옮기고, 100mM PMSF 400㎕을 넣고 stirring 해준다.그리고 conical tube에 담긴 Sample에 lysis buffer를 20㎖ 넣고 75℃ water bath에서 1시간동안 incubation 해준다.

 

<Storage buffer>

1M Tris-Cl pH 7.9 150㎖

1M Kcl 150㎖

500mM EDTA 600㎕

1M DTT 3㎖

100mM PMSF 15㎖

Glycerol 1.5L

최종 양 3L

 

Ammonium sulfate를 이용해 침전을 할 것이므로, 1시간 incubation하는 동안 ammonium sulfate를 8g을 덜어내서 막자사발로 갈아준다. Storage buffer를 만들기 위해 먼저 증류수 500㎖을 넣고, 1M Tris-Cl pH 7.9를 150㎖ 넣는다. 그리고 1M KCl 150㎖과 500mM EDTA 600㎕, 1M DTT를 3㎖를 차례대로 넣는다. 그리고 serine과 threonine protease inhibitor인 100mM PMSF 15㎖, glycerol을 1.5L도 차례대로 넣고, 마지막으로 DW로 3L 눈금을 맞춘다.

 

Incubation에서 꺼낸 Sample을 centrifuge tube에 20㎖씩 밸런스를 맞추어 나누고 15000rpm(24878g), 4℃ 10분 centrifuge 시킨다. 원심분리가 되고 있는 동안에 dialysis tube를 적당한 길이로 잘라 DIW에 넣어 4℃에 보관하여 activation시킨다.그리고 원심분리가 끝나면, 침전물이 생겨 pellet이 생긴다. Supernatant를 25㎖ 비커에 옮겨 담고, pellet의 반대편으로 옮겨 담는다.

 

앞에서 갈았던 ammonium sulfate가 잘 갈렸다면, 빠르게 stirring 해주며 ammonium sulfate을 조금씩 8g을 넣는다. 이 때, 염 농도가 갑자기 올라가면 Taq polymerase 단백질 외에 다른 물질들도 침전이 되기 때문에 주의해야한다. 약 한시간 후에 뿌옇게 침전된 것을 확인한다. 이것을 새 centrifuge tube에 옮겨 담고, 두 centrifuge tube 간의 balance를 맞춰준 후에, 15000rpm 4℃ 10분 centrifuge 해준다.

 

원심분리가 끝나면 supernatant를 제거하고 pellet에 Resuspension buffer 2㎖을 넣어 resuspension 시킨다. Resuspension이 끝나면 얼음에 보관한다. 전에 activation을 시켜놓은 dialysis tube를 두 번 접어서 끝을 clip으로 고정하고 물을 조금 넣어 물이 새는지 확인하고, 새지 않으면 물을 다 빼준다.

 

Dialysis tube에 sample을 담고 거품은 최대한 위로 빼준다. 그리고 남은 끝을 Clip으로 고정시키고 dialysis tube를 눌러 새지 않는지 확인한다. Dialysis tube를 Storage buffer에 담근 뒤 천천히 Stirring 을 하며 cold room 에서 보관한다. 이때, 4시간마다 Storage buffer를 갈아주어야 한다.(총 2번) Dialysis가 끝나면 e-tube에 나누어 담아, 얼음에 보관한 뒤 -80℃에서 보관한다.

 

3. 재조합 단백질 Taq polymerase의 확인

Taq DNA polymerase는 -80℃에서 꺼낸 뒤 얼음에 넣어 천천히 녹인다. Taq DNA polymerase를 serial dilution할 때, 원래의 1X로부터 1/4X, 1/8X, 1/16X로 희석한다. 희석용액 1/4X는 30㎕의 DW에 10㎕의 1X Taq polymerase를 넣고, Tube를 위 아래로 흔들어 섞는다.

 

희석용액 1/8X는 20㎕의 DW에 1/4X dilution을 20㎕를 섞어서, 희석용액 1/16X는 20㎕의 DW에 1/8X dilution을 20㎕를 섞어 만든다. 아래의 표는 PCR product를 합성하기 위한 master mix의 조성과 양이다.

 

<Master mix>

Taq polymerase 0.5㎕

dNTP 250mM 2㎕

10X Taq buffer 2㎕

F primer 1㎕

R primer 1㎕

Template 1㎕

DW 12.5㎕

최종 양 20㎕

 

Taq polymerase는 마지막에 따로 넣고 나머지만 sample 수 10개에 넉넉하게 2를 추가하여 12 volume으로 master mix를 한 e-tube에 미리 섞어 준다. 총 20㎕에서 taq polymerase의 volume(0.5㎕)만 뺀 19.5㎕를 각 PCR tube에 분주할 것이다. 이 때, PCR rack과 PCR tube는 얼음에 놓고 사용한다.

 

Master mix를 만들기 위해, 가장 양이 많은 DW부터 150㎕ 넣고, 10X PCR buffer를 24㎕ ,2.5mM dNTP도 24㎕ 넣는다. 그리고 Reverse primer는 12㎕, Forward primer도 12㎕ 넣는다. 본 실험에서 사용되는 eGFP forward primer와 eGFP reverse primer의 서열은 다음과 같다.

 

eGFP forward primer	5’-CATATGCGTATCGATTCAGC-3’
eGFP reverse primer	5’-AAGCTTTACTTGTACAGCTC-3’

 

마지막으로 5369bp인 Template DNA도 12㎕ 넣어준 후에, Master mix를 vortexing으로 섞는다. 10X Taq buffer에는 72℃의 환경에서도 적정 pH 7.2를 유지시키는 Tris-HCl(pH 8.3-8.8)과 DNA backbone의 음전하를 중화시켜주는 KCl이온 그리고 polymerase의 활성에 필요한 MgCl₂가 들어간다.

 

PCR tube에 master mix를 각각 19.5㎕씩 넣는다. 첫 PCR tube는 대조군이기 때문에, Taq polymerase를 넣지 않고 대신 0.5㎕ DW를 넣는다. 이때 넣는 양이 매우 적으므로 2P pipette을 사용한다.

 

두번째부터는 실험군이므로 commercial taq polymerase를 0.5㎕(2U) 넣고, 세번째 tube부터는 taq-1X, 1/4X, 1/8X, 1/16X를 각각 0.5㎕를 넣는다. Taq을 넣어준 PCR tube를 tapping으로 잘 섞고 한 번 spin down을 해준다. PCR기기에서 PCR cycle을 설정한 후에 PCR tube를 넣고, 시작버튼을 눌러 PCR를 시작한다. PCR이 되는 동안 gel을 만든다. 약 2시간 뒤, PCR이 끝나면 program을 종료하고, PCR tube를 꺼내고 기계를 끈다.

 

Poly grove를 끼고 저울로 agarose powder 1.2g을 측정하여 삼각플라스크에 붓는다. 여기에 1X TAE buffer 60㎖을 붓는다. TAE buffer는 40mM Tris-acetate와 1mM EDTA로 구성되어있다. 전자레인지에 넣기 전 플라스크를 흔들어 powder를 녹이고 삼각플라스크 입구를 비닐랩으로 싸서 구멍을 뚫고 전자레인지에 넣어 agarogel을 잘 녹인다.

 

만약 30초를 돌렸는데도 녹이 않으면 30초 정도 더 돌린다. 그리고 Stirrer를 이용해 powder가 엉기지 않게 완전히 녹은 것을 확인한다. Gel plate에 comb을 꽂은 후에, EtBr을 넣고 잘 섞는다. 여기에서 EtBr은 double strand의 DNA의 염기서열 결합에 끼어들어가 DNA를 전기영동에서 가시적으로 보이게 하는 염색제 역할이다.

 

Agarose gel이 잘 녹은 것을 확인하고 gel plate에 붓는다. 이때 기포가 생기지 않도록 천천히 붓는다. 그리고 Agarose gel이 굳도록 20분을 기다린다. 잘 굳은 것을 확인하면, comb을 제거하고, 바닥에 찌꺼기도 제거한다. 그리고 이를 1X TAE buffer에 담그고 뚜껑을 닫아 보관한다. PCR tube의 벽면에 있는 product를 모아주기 위해서 Spin down을 해준 후에 6X loading dye를 e-tube에 4㎕씩 넣는다.

 

Tapping으로 섞고 spin down을 한 번 해준다. 장갑을 끼고 보관했던 gel을 꺼내서 gel tank에 넣고 DNA ladder를 5㎕ 넣는다. 순서대로 20㎕씩 loading을 해 줍니다. 이 때 Pipette은 수직으로 well에 들어가도록 천천히 loading을 해준다. Loading이 끝나면 tank의 뚜껑을 닫고, 기계의 전원을 킨다.

 

시간을 40분, 150V로 설정을 해 주고 Run을 눌러 전기영동을 해준다. Tank의 극에서 기포가 올라오는지 확인을 하고, Dye가 내려가는 것을 통해 전기영동의 진행이 얼마나 되었는지 눈으로 확인하고, 완료되면 기계의 전원을 끄고 gel을 빼 준다. 전기영동이 완료된 Gel을 UV detector에 올려놓고, 암전의 상태에서, UV detector의 전원을 켜 결과를 낸다.

 

 

 

[분자생물학실험]Buffer 및 Media 제조와 재조합 단백질 Taq DNA Polymerase 발현, 정제와 측정 레포트