분자생물학실험 | Scalp와 Skin에서의 미생물 DNA 추출 그리고 NGS를 통한 미생물 분석

 

 

 

성공적으로 DNA를 만드는 것은 더 이상의 농축이 필요 없는 아주 진한 농도의 DNA 용액을 얻는 것이다. 그렇지만, 때때로 희석용액이 얻어지기 때문에 DNA 농도를 증가시키는 방법을 고려하는것이 중요하다. 가장 널리 사용되는 농축 방법은 에탄올 침전법(Ethanol precipitation)이다. 염 존재하에서, -20나 그 이하의 온도에서 무수 에탄올은 고분자 핵산을 효과적으로 침전시킨다. DNA의 농축용액에서는 에탄올이 샘플의 위층에 놀이게 되어, 분자들이 두 층 사이에 침전된다. 에탄올이 묽은 DNA 용액과 섞여질 때는 침전이 원심분리에 의해 모아질 수 있으며 적당한 부피의 물에 재용해될 수 있다. 에탄올 침전법은 용액에 짧은 길이와 단량체 핵산 성분을 남게하는 잇점이 추가로 있다. 그러므로 ribonuclease처리에 의해 생성된 ribonucleotide는 이 단계에서 제거가 된다

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실험 방법

1. 실험 과정

두피를 Swab을 이용해서 50회 정도 긁은 후에 e-tube를 준비하여 면봉 쪽을 넣은 후에 Scalp라고 라벨링한다. 그리고 귀 뒤쪽에 있는 피부도 동일하게 Swab을 이용해서 긁은 후에 Skin으로 e-tube에 라벨링해준다. 여기에 200㎕의 ST buffer를 두 개의 e-tube에 넣은 후에 vortexing을 해준다. 그리고 짧게 Spin down한 후에 10분동안 상온에서 incubation하고 Proteinase K를 15㎕만큼 넣은 후에 200㎕의 Lysis buffer를 넣고 짧게 Vortexing한다.

 

이를 70의 Waterbath에 20분동안 넣고 이후 꺼내어 Ice에서 5분동안 둔다. 그 동안 55 Waterbath에 Elution Buffer를 미리 넣어둔다. Ice에 넣어둔 e-tube를 꺼내서 Spin down해준 후, 200㎕의 100% Ethanol을 넣어 Pipetting 후 이를 Filter column에 넣은 후에 1분 동안에 8000rpm에서 원심분리한 후에 Flow Through를 버린다.

 

Column에 700㎕의 Wash Buffer1을 첨가하고 앞과 동일하게 1분간 8000rpm에서 원심분리후에 Flow Through를 버린다. 또한 500㎕의 Wash Buffer2를 첨가해 3분동안 최대 rpm에서 원심분리하고 Flow Through는 버린다. 이제 새로운 collection-tube를 준비한 후에 column을 끼우고 앞에서 미리 warming해놓은 60㎕의 Elution Buffer를 넣고 상온에서 5분동안 Incubation한다. 그리고 최대 rpm에서 1분동안에 원심분리를 하고 이를 새로운 e-tube로 옮기고 흡광도를 측정한다. 이 때, Elution Buffer 20㎕로 blank를 잡는다.

 

DNA sample를 PCR plate에 5㎕만큼 넣은 후에 2.5㎕의 Amplicon PCR primer를 각각의 well에 넣고 12.5㎕의 2X KAPA Hifi Hotstart Ready mix도 넣고 D.W는 각각 2.5㎕만큼 첨가한다. 그리고 이를 Vortexing해서 짧게 spin down해주고 Amplicon PCR을 시작한다. 총 25cycle을 진행한다.

 

그리고 7㎕의 1X Loading Dye를 새로운 plate에 넣은 후에 얻은 Amplicon PCR 산물을 5㎕만큼 따서 넣고 섞어준다. 이 Plate를 spin down해준 후에 전기영동기계에 들어간 2% Agarose gel well에 loading한다. 7㎕의 Marker도 동일하게 loading하고 30분 동안 130V에서 전기영동하여 그 결과를 확인한다.

 

반응	온도(℃)	시간
Pre-Denaturation	95	3min
Denaturation	95	30sec
Annealing	55	30sec
Extension	72	30min
Post-extension	72	5min
Hold	4

 

AMPure XP bead를 준비하여 1분동안 vortexing으로 풀어 20㎕만큼 분주해서 sealing하여 2분동안 18000rpm에서 Shaking해준다. 그 동안 80% Ethanol을 만든다. 그리고 짧게 Spindown하고 5분 동안 상온에 둔 후에 2분동안 Magnetic stand에 두고 Sup을 제거한다. 만든 80% Ethanol을 180㎕만큼 따서 넣어준 후에 30초간 둔다.

 

다시 Sup을 없앤 후에 다시 80% Ethanol을 분주하고 Sup을 제거한다. 그리고 10분동안 공기중에 말리고 말린 bead를 확인해 25㎕의 DW를 각각 분주한 후에 2분동안 1800rpm에서 shaking한다. Shaking 후 vortexing하고 짧게 spindown해서 2분동안 실온에서 둔다. 그리고 이를 magnetic stand로 옮기고 2분동안 incubation하여 새 plate에 20㎕ sup을 넣는다.

 

이제 Index PCR를 위해 D.W를 2.5㎕만큼 각각 넣고, 2X KAPA Hifi Hotstart Ready mix는 12.5㎕만큼, Index PCR primer는 2.5㎕만큼 각각 well에 넣어준다. 그리고 5㎕만큼 sample을 넣은 후에 짧게 spin down하여 Index PCR을 시작한다. 총 8cycle을 진행한다. 그리고 앞에서 해준 Clean up을 다시 해준다.

 

Index PCR product를 2㎕만큼 따서 Black 96well Plate에 넣는다. 그리고 100㎕씩 Standard Dilution을 각각 첨가한 후에 25ng/㎕과 50ng/㎕의 샘플도 같이 넣는다. 98㎕의 1X TE Buffer를 샘플이 들어가있는 well에 넣고 100㎕의 Picogreen을 넣고 1분동안 1600rpm에서 섞어준 후에 spin down해서 상온에서 10분동안 둔 후에 농도 측정을 진행한다.

 

반응	온도(℃)	시간
Pre-Denaturation	95	3min
Denaturation	95	30sec
Annealing	55	30sec
Extension	72	30min
Post-extension	72	5min
Hold	4

 

이 때, Library들을 4㎚로 맞춘 후에 새로운 e-tube에 모은다. PhiX와 0.2N NaOH 역시 4㎚로 희석한 뒤에 5㎕만큼 4㎚로 맞춘 Library, 0.2N NaOH 5㎕을 섞는다. 그리고 0.2N NaOH와 PhiX도 각각 5㎕만큼 넣고 섞은 후에 Spindown을 하고 상온에서 5분동안 incubation한다.

 

Incubation이 완료되면 990㎕의 Hybridization buffer를 10㎕의 denatured PhiX와 denatured library pool에 각각 넣어준다. 그리고 이 두개의 e-tube를 잘 vortexing하여 짧게 spindown해준다.

 

420㎕만큼의 Hybridization buffer를 20pM denatured library와 섞고, 420㎕만큼의 Hybridization buffer를 20pM Phix와도 섞는다. 그리고 두개의 e-tube에 대해 vortexing하여 짧게 spindown해준다. 150㎕만큼을 얻은 6pM denatured library e-tube에서 딴 후에 버리고 6pM denatured phiX를 여기에 넣어준다.

 

앞과 동일하게 vortexing으로 섞은 다음에 짧게 원심분리한다. 그리고 카트리지를 위아래로 흔든 후에 1㎖ 팁을 사용해서 sample이 들어갈 inlet에 공간을 확보하고 여기에 샘플을 600㎕만큼 로딩한다. 이후에 Incorporation Buffer를 위아래로 흔들고 Flow cell은 D.W로 세척해준다. 그리고 Flow cell을 기계 안에 넣은 후에 Buffer도 넣고 마지막으로 카트리지로 넣는다. 총 618의 cycle로 설정을 한 뒤에 3일동안 측정한다.

 

 

 

[분자생물학실험]Scalp와 Skin에서의 미생물 DNA 추출 그리고 NGS를 통한 미생물 분석 레포트