일반생물학실험 | Cell fractionation and isolation of chloroplasts

 

 

 

 

TIP

 

 

식물을 세포 분획법을 거쳐 관찰한다. 이를 통해 식물세포의 세포 기관들을 알아본다.

 

 

 

세포 균질화

생물의 조직을 갈아 부숨으로 얻어진 것을 말한다. 세포기관들을 분리하기 위해서는 먼저 분해되어야 하는데, 이것이 ‘균질화’ 과정이다. 보통의 방법으로는 핵이나 미토콘드리아 등의 세포 내 과립이 파괴되지 않기 때문에 세포 성분의 분화, 추출재료로서 이용된다. 균질화는 막자사발, 세제 처리, 기계의 절단 등의 다양한 절차에 의해 이루어질 수 있다.

 

 

세포 분획법

세포를 파쇄 하여 특정한 세포 소기관을 포함한 세포 분획을 초원심 분리기나 전기영동법 등으로 분리하여 조제하는 방법. 이렇게 얻은 시료는 분획이라 한다. 세포소기관의 분자 구측이나 기능 연구에 널리 사용할 수 있다. 목적인 세포소기관에 따라 최고의 세포분쇄법, 용액의 염농도나 삼투압, 설탕, 피콜의 농도, 단백질 분해효소의 저해법, 원심방법이나 원심조건 등을 결정하여 사용한다. 세포의 파쇄는 균질기 등에 의한 기계적 파쇄법이나 초음파처리 등을 사용한다. 세포를 파쇄하여 얻어낸 현탁액을 균질액이라 한다.

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실험 방법

1. 엽록체 분리

1) 얼음 중탕기, 미리 냉각한 격리 완충제, 사용될 모든 튜브들을 준비한다.

 

2) EP-tube 4개에 각각 A1, A2, B1-1', B2-1'를 라벨링한다.

 

3) 15㎖ 원심분리 튜브 13개에 각각 Buf, 15sec, 45sec, B1-1', B2-1', B1-2', B2-2', SN1, SN2, B1-Abs, B2-Abs, SN1-Abs, SN2-Abs를 라벨링한다.

 

4) 신선한 시금치 잎을 몇 개 골라 잎들을 떼어 내어 큰 잎맥들을 제거한다.

 

5) 잎 조직을 최소 1㎝ x 1㎝로 절단한다.

 

6) 찢어낸 시금치 잎들을 차가운 믹서 컵에 넣고 150㎖의 냉각시킨 격리 완충제를 더한다.

 

7) 15초간 갈아낸다.

 

8) 균질화된 세포 추출액의 반을 3겹의 직포로 덮은 비커에 넣고(4℃이전에 보관), 여과된 액체를 15sec 라벨링한 원심분리 튜브에 옮겨 담는다.

 

9) 나머지를 30초간 더 갈아낸다.

 

10) 균질화된 세포 추출물을 3겹의 직포로 덮은 비커에 넣고(이전에 4℃로 보관), 여과된 액체를 45sec 라벨링한 원심분리 튜브에 옮겨 담는다. 비커에서 거를 때 필요한 경우 장갑을 이용하여 직포의 양쪽을 잡아 짜낸다.

 

11) 직포에 남아 있는 부분을 조금 떼어 내어 0.5㎖의 버퍼와 섞어 15초 갈아낸 부분은 A1, 45초 갈아낸 부분은 A2 라벨링한 EP-tube에 넣고 얼음 속에 보관한다.

 

12) 15sec, 45sec 라벨링한 원심분리 튜브를 200 × g, 2분, 4℃에서 원심 분리한다.

 

13) 15sec, 45sec 라벨링한 원심분리 튜브 속 상청액을 B1-1', B2-1' 라벨링한 원심분리 튜브로 옮기고 200 × g, 2분, 4℃에서 원심 분리를 반복한다.

 

14) 상청액을 냉각시킨 B1-2', B2-2' 라벨링한 원심분리 튜브로 옮기고 1000 x g, 10분, 4°C에서 원심 분리한다.

 

15) 상청액을 냉각시킨 SN1, SN2 라벨링한 원심분리 튜브로 옮긴다.

 

16) B1-1', B2-1' 라벨링한 원심분리 튜브 속 알갱이를 건조 시켜 B1-1', B2-1' 라벨링한 EP-tube에 옮겨 닮고 1㎖의 버퍼를 넣고 섞어 준다.

 

2. 엽록소 함량 측정 & 현미경 관찰

1) B1-Abs, B2-Abs, SN1-Abs, SN2-Abs 라벨링한 원심분리 튜브에 B1, B2, SN1, SN2 용액 0.5㎖와 아세톤 4㎖를 넣는다.

 

2) 0.5㎖의 물을 넣고 섞는다.

 

3) 1000 × g, 5분, 4℃에서 원심 분리한다.

 

4) 모든 용액의 0.5㎖를 큐벳에 옮긴 후 645 ㎚에서 663 ㎚로 흡광도를 측정한다.

 

5) Arnon의 방정식을 이용하여 엽록소 함량을 계산한다.

 

6) EP-tube에 담긴 4개의 용액을 각각 현미경을 통해 관찰한다.

 

 

 

 

[일반생물학실험]Cell fractionation and isolation of chloroplasts 레포트