분자생물학실험 | A. Tumefaciens의 Ti-plasmid를 이용한 담배식물체의 발현위치와 상호작용

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

분주되어 있는 A. Tumefaciens (strain: GV3101)c-cell을 -70 Deep Freezer에서 꺼내 얼음에 담근다. 5분 정도 녹인 c-cell에 plasmid의 양을 1㎍, 0.1㎍, 0.01㎍로 다르게 넣어주고 c-cell이 깨지지 않게 조심스럽게 tapping하고 액체 질소에 2분 동안 얼리고 5분동안 waterbath에서 녹여준다. 그리고 다시 액체 질소에 동일하게 얼리고 waterbath에서 동일하게 녹여주어 형질전환의 효율을 높인다.

 

그 다음, 각각의 e-tube에 YEP medium을 1㎖만큼 넣어주고 200rpm으로 28의 shaking incubator에서 1시간동안 둔다. 그리고 5000rpm에서 3분간 원심분리를 하고 cell pellet을 확인한 후에 상층액은 피펫으로 제거한다. 그리고 100㎕의 YEP medium을 넣어 cell pellet을 풀어주고 100㎕만큼 따서 6.50㎍/㎖ Spectinomycin과 50㎍/㎖ Rifampicin이 항생제로 들어가 있는 배지 plate에 Spreading해준다. 이후 뒤집어서 28 incubator에서 이틀 간 배양해준다.

 

아그로박테리움을 infiltration하기 위한 담배식물체를 키우기 위해 먼저 Pearlite와 상토가 1:3 비율이 되도록 하고 두 개를 잘 섞어주고 다시 물을 한 컵정도 넣어서 다시 잘 섞는다. 그리고 화분에 흙을 담은 후에 이제 씨를 심는다. Nicotiana benthamiana 2알을 손에 덜어서 화분별로 뿌려주고 수분이 충분하도록 싹 틀 때까지 비닐랩으로 막아서 식물배양실에 둔다. 조건을 광의 세기를 다르게 하여 Low light와 normal light 그리고 high light에서 키운다.

 

Colony PCR를 위해 먼저 6개의 e-tube를 준비하여 50㎕의 DW를 넣고 알코올램프를 이용해서 이쑤시개를 소독하여 YEP plate에서 얻은 transformation된 colony를 이쑤시개로 찍어서 e-tube에 푼다. 그리고 나머지 2개 plate도 동일한 과정을 거친다. E-tube들을 철로 된 랙에 꽂아서 10분동안 끓인 다음에 3분 동안 얼음에 박아서 식혀주고 13000rpm에서 1분동안 원심분리한다. 새로운 e-tube를 하나 꺼내서 PCR mixture를 만들어준다.

 

먼저 DW 79.8㎕만큼 넣고 12㎕만큼의 10X buffer를 넣는다. 이 때 넣어주는 순서는 양이 많은 순서부터 넣어준다. 그리고 dNTP는 6㎕만큼 넣고 마지막으로 DNA Taq polymerase를 꺼내서 1.2㎕만큼 넣어주고 살살 Tapping해준다. 그 후에 6개의 PCR tube에 섞어준 PCR mixture를 16㎕씩 나눠 넣어준다. 그리고 PCR tube는 2개씩 같은 primer를 사용할 것이다.

728x90

앞에서 원심분리가 완료된 Cell lysate를 3㎕씩 넣어준다. 2개의 PCR tube에 MYB94-F primer와 eYFP-R primer를 사용하고, 다른 2개의 PCR tube에는 MAGL4-F primer와 eYFP-R primer를 사용한다. 마지막으로 2개의 PCR tube에 MAGL10-F primer와 eYFP-R primer를 사용한다. 각각을 0.5㎕만큼 넣어준 후에 tapping해준다. 그러면 각각의 PCR tube에 들어간 양은 20㎕로 다음 표와 같은 조성을 가진다.

 

	양(㎕)		양(㎕)
DW	12.8	Forward primer	0.5
Cell Lysate	3	Reverse Primer	0.5
10X Buffer	2	Taq DNA polymerase	0.2
dNTP	1	Total	20

 

PCR조건은 아래의 표를 따른다. 이때 Denaturation과정부터 Extension과정을 총 30cycle만큼 설정한다.

 

온도(℃)	시간	온도(℃)	시간
95(Pre-Denaturation)	3분	72(Extension)	0.5kb 당 30초
95(Denaturation)	30초	72(Final-Extension)	7분
55(Annealing)	40초	4(Stroage)	-

 

PCR 완료 후에는 PCR이 제대로 되었는지 확인하기 위해서 전기영동을 한다. 먼저 agarose 0.2g을 비커에 넣은 후에 1X TAE buffer 20㎖을 부어서 1% Agarose를 만들고 랩으로 뚜껑부분을 씌운 후에 구멍을 뚫어주고 전자레인지에 1분간 돌린다. 그리고 만들어진 아가로즈젤을 Gel tray에 붓고 굳힌다. 그리고 DNA marker와 MYB94-F primer, MAGL4-F primer와 MAGL10-F primer를 넣은 2개의 colony PCR product 총 6개를 순서대로 로딩한다. 25분간 전기영동을 완료하면 Gel detector를 통해서 밴드를 확인한다.

 

저번 실험에서 키운 담배 식물체에 infiltration을 하는 Tobacco infiltration실험을 진행하기 위해 먼저 Infiltration solution을 만든다. 먼저 D-Glucose 0.5g을 재서 concial tube에 넣고 5㎖의 DW를 넣어준 후에 잘 섞이도록 vortexing해준다. 그리고 100㎕의 1M MgCl2와 pH가 5.7인 100㎕의 1M HES도 넣어준다. 그리고 100㎕의 1M Acetosyringone을 넣고 마지막으로 10㎖이 되도록 DW를 넣는다.

 

MYB94, MAGL4와 MAGL10이 각각 eYFP와 fusion 되어있는 총 3가지 종류의 Cell이 각각 600㎚에서 Spectrophotometer로 재었을 때 약 0.8의 흡광도를 될 때까지 키운다. 이때 흡광도를 잴 때의 Blank는 YEP medium으로 설정한다. 그리고 정제된 cell을 담배식물에 infiltration하기 위해서 Cell Wash과정을 거친다.

 

먼저 세 종류의 Cell을 각각 e-tube에 1㎖만큼 넣고 5000rpm에서 3분동안 원심분리한 후에 상층액을 제거하고 위에서 만든 Infiltration solution을 1㎖만큼 넣은 후에 cell pellet을 resuspension한다. 그리고 동일한 원심분리 조건에서 원심분리하고 다시 상층액 제거 후에 Infiltration solution을 1㎖만큼 넣어 풀어준다. 이제 담배 잎의 뒷면에 접종을 해주면 된다. Cell wash가 마친 MYB94, MAGL4와 MAGL10와 eYFP가 각각 fusion 된 총 3가지 종류의 Agrobacteria cell들이 들어있는 e-tube를 inverting하여 위 아래로 섞어주고 200㎕만큼을 1㎖ 주사기를 이용해서 3-4번째의 담배잎 뒷면에 찔러서 용액을 넣어준다.

 

용액을 넣어준 후에는 먼저 휴지로 잘 닦아준 다음에 접종한 부위를 표시하고 단백질의 이름을 적어서 구분한다. 그리고 Infiltration이 완료되었다면 생장실에서 48시간동안 키운 다음에 꺼낸다. 그리고 형광을 관찰하기 위해 먼저 Slide glass와 Cover glass를 준비하고 Infiltration한 부위를 가로와 세로가 0.3㎜에서 0.5㎜정도 되게 작게 잘라주어 핀셋을 이용하여 Slide glass에 얹는다. 담배잎의 뒷면에 DW를 소량 얹은 다음에 버블에 유의하여 cover glass를 담배잎 위에 얹어준 후, DW를 소량 뿌려서 고정시킨다.

 

마지막으로 이렇게 만든 샘플들을 형광현미경으로 관찰한다. 먼저 사용하기 5분 전에 기계를 워밍해 둔 후에 1번 filter를 통해서 상이 제대로 맞추어졌는지 관찰하고 상이 제대로 맞추어졌다면 필터를 이용해서 빛을 덮은 후에 5번 filter로 바꾸어 형광을 키고 GFP 형광 signal을 관찰한다.

 

마지막 단백질과 단백질 간의 상호작용을 분석하는 실험으로, 먼저 실험에 필요한 Infiltration solution을 10㎖만큼 만들기 위해 저울을 이용해서 0.5g의 5% D-Glucose를 재고 15㎖의 conical tube에 담는다. 그리고 DW를 5㎖만큼 넣고 vortxing시킨 후에 1M MgCl2과 1M MES을 각각 100㎕만큼 추가한다. 그리고 마지막으로 형질전환 효율 증가를 위해 1M Acetosyringone을 2㎕만큼 넣은 후에 vortexing으로 섞어준다.

 

키운 cell의 농도를 재기 위해서 600㎚에서의 흡광도를 Spectrophotometer로 잰다. YEP media로 blank로 잡아주고 NSN1과 fusion된 cEYFP cell, NSN1과 fusion된 nEYFP cell, PES과 fusion된 cEYFP cell, PES와 fusion된 nEYFP cell 그리고 P19 cell을 각각 1㎖씩 큐벳에 넣는다.

 

Exponential phase에 있는 cell을 얻고 싶기 때문에 흡광도값이 0.8에 가깝도록 하고 만약 이 농도에 가깝게 나오면 Cell wash과정으로 들어간다. 먼저 키운 세포액을 5000rpm에서 3분간 원심분리를 하고 상층액은 버린 후에 앞에서 만든 Infiltration 용액 1㎖을 첨가하여 pellet을 resuspension시켜준다.

 

그 후 다시 동일한 조건으로 원심분리를 하고 상층액을 버린 다음에 Infiltration solution을 1㎖만큼 넣고 다시 resuspension시킨다. Cell wash과정이 끝나면 PES단백질과 NSN1 단백질의 상호작용을 알아보기 위해 PES과 fusion된 cEYFP cell 200㎕과 NSN1과 fusion된 nEYFP cell 200㎕ 그리고 p19cell을 200㎕만큼 넣고 위아래로 흔들어 inverting시켜 섞는다.

 

PES과 fusion된 nEYFP cell 200㎕과 NSN1과 fusion된 cEYFP cell 200㎕ 그리고 p19cell 200㎕도 동일하게 섞는다. 이 때, p19cell은 단백질 발현증가를 위해 첨가한다. 이 과정까지 끝나면 이제 키운 담배식물체의 3-4번째 잎의 뒷면에 1㎖주사기를 이용해서 섞은 용액의 200㎕만큼을 주사하고 휴지로 닦아낸 후에 주입된 영역을 펜으로 표시하고 이름을 적는다.

 

Infiltration이 완료된 담배식물체는 반응시키기 위해 48시간동안 배양실로 옮긴다. 그리고 DAPI염색을 위해서 키운 담배식물체의 infiltration 영역을 0.2㎜에서 0.4㎜정도의 크기로 자르고 5㎍/㎖ DAPI 염색약에서 5분간 반응시킨다. 그 후에는 DW를 올려놓은 Slide glass에 자른 잎을 올리고 그 위에 DW를 올려 cover glass로 고정한다.

 

고정이 완료되면 광학현미경의 1번 Filter로 상을 맞추고 4번 UV Filter로 DAPI염색 결과를 관찰한다. 그리고 마지막으로 5번 Filter로 전환하여 GFP의 형광signal결과를 확인한다.

 

 

 

[분자생물학실험]A. Tumefaciens의 Ti-plasmid를 이용한 담배식물체의 형질전환, 단백질의 발현위치와