분자생물학실험 | Competent cell을 통한 형질전환효율 측정 그리고 전기영동

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

200㎖의 LB 배지를 만들기 위해서 먼저 가장 양이 많은 160㎖의 DIW(Deionized Water)를 비커에 채우고 용액을 섞기 위한 magnetic bar도 같이 넣어준다. 그리고 1%의 농도가 되도록 NaCl 2g을 넣고 0.5%의 Yeast extract가 되도록 1g을 넣는다. Tryptone도 1%가 되도록 2g만큼 넣어준 후에, magnetic bar로 섞는다. 이후 200㎖까지 남은 양은 DIW로 채워준다. 이후 멸균을 위해서 15분 동안 121에서 15psi로 autoclave를 시키고 끝나면 4에 둔다. 이후에 있을 실험을 위해서 agar plate가 필요하므로, Ampicillin과 Kanamycin agar plate를 만들어야 한다.

 

먼저 1000㎖의 양으로 만들기 위해 DIW를 비커에 800㎖만큼 넣는다. 그리고 동일하게 magnetic bar도 같이 넣어준 후에 앞과 동일한 NaCl과 yeast extract 그리고 Tryptone이 되도록 각각 10g, 5g 그리고 10g씩 넣어준다. 또한 고체배지는 agar를 넣어주어 고형화시키는데 Agar가 1.5%가 되도록 총 15g만큼 넣고 충분히 섞어준 후에 500㎖만큼 두 개의 비커에 넣고 autoclave를 위해 호일로 뚜껑부분을 잘 감싼 후에 앞과 동일한 조건에서 멸균한다.

 

멸균 후 식히고 100mg/㎖의 농도를 가진 Ampicillin과 Kanamycin이 모두 50l/㎖이 되도록 해당 양만큼 넣어준 후에 다시 섞고 dish 높이의 반 정도 차도록 부어주고 식혀서 굳혀준다. 이후 보관할 때는 수증기 방지를 위해 뒤집어 보관한다. Transformation에 필요한 c-cell을 만들 때 필요한 시약으로는 CaCl₂용액과 30% Glycerol이 있다.

 

먼저 100㎖의 0.1M CaCl₂ 용액을 만들기 위해서는 비커에 DIW 80㎖을 넣은 후 0.1M이 되도록 CaCl₂ 를 넣고 magnetic bar를 이용해서 섞어준다. 그리고 100㎖을 채우기 위해 남은 부분은 DIW를 넣어준다. 앞과 동일한 조건에서 autoclave를 해주고 4에 둔다. 10㎖의 30% glycerol을 만들때는 DIW를 7㎖만큼 플라스크에 넣고 100% Glycerol을 3㎖만큼 넣어 30% glycerol을 완성한다. 그리고 플라스크를 autoclave시키고 4에 둔다.

 

Competent cell을 만들기 위해 먼저 시험관에 LB 3㎖을 미리 넣어둔다. Streaking하여 배지 plate에서 자란 DH5의 여러 colony들 중에서 single colony만을 200p tip을 이용해서 딴다. 그리고 미리 준비한 LB가 들어가있는 시험관에 넣는다. 시험관을 37도 200rpm의 조건으로 shaking incubator에 넣고 overnight시킨 후에 시험관을 꺼낸다. 새로운 플라스크에 LB를 100㎖만큼 넣고 배양한 세포배양액 중에서 1㎖을 따서 넣는다. 그리고 이전과 동일한 조건으로 배양시킨다. Spectrophotometer를 이용해서 600㎚에서의 흡광도가 0.4와 0.6 사이의 값이 나올 때까지 배양한다.

 

흡광도를 측정할 때는 LB 1㎖을 이용해서 blank를 설정하고 샘플을 측정할 때는 cuvette을 DIW로 헹군 다음에 잰다. 0.4와 0.6 사이의 값에 도달하면 샘플을 얼음에 30분동안 넣어서 대장균의 성장을 멈춘다. 그리고 100㎖의 세포배양액이 들어있는 플라스크를 50㎖ conical tube에 50㎖ 배양액씩 나누어 넣어준다. 이 conical tube를 4100rpm에서 원심분리를 한 후에 pellet을 확인하고 상층액은 버린다. Pellet이 잘 풀리도록 찬 0.1M CaCl₂ 용액 10㎖을 넣고 resuspension시킨다. Resuspension시킬 때는 1000p tip의 끝을 잘라서 cell에 자극을 주지 않고 충분히 덩어리가 없어질 만큼 풀어준다.

 

10분동안 원심분리를 하는 동안 microtube를 얼음에 박아둔다. 원심분리가 끝나면 상층액을 버리고 다시 0.1M CaCl₂ 2㎖을 넣는다. 그리고 30% glycerol 2㎖을 넣는다. 두개의 conical tube에 분리했던 세포액을 다시모아 4㎖이 되게하여 c-cell농도가 높인다. Pellet을 풀어준 후에 microtube에 100㎕씩 분주하고 영하 80℃ Deep Freezer에 넣는다.

 

Transformation efficiency를 계산하기 위해 Deep Freezer에서 c-cell을 꺼내고 얼음에 둔다. pUC19 plasmid DNA(50pg/㎕)을 분주해놓은 c-cell에 2㎕만큼 넣는다. 조심스럽게 tapping하고 5분 후에 1분 30초동안 42℃의 water bath에서 heat shock을 한다.

 

그리고 얼음에서 5분간 식힌 후에 900㎕ LB를 넣고 37℃ 200rpm에서 30분동안 shaking incubator에 둔다. 30분이 끝나면 ampicillin-LB plate에 100㎕만큼 배양액을 뿌리고 cell spreader로 도말한다. Spreading이 끝나면 습기방지를 위해 plate를 뒤집어 37℃에서 overnight시킨다. 그 다음날 colony의 개수를 센다.

 

PCR을 진행하기 위해서는하나의 Microcentrif㎍e tube에 dNTP와 Taq polymerase가 포함되어있는 2X PCR master mix를 50㎕만 넣어준다. 본실험에서는 이후에 NdeI와 HindIII을 제한효소로 사용할 것이므로 이들 제한효소의 인식부위가 들어가있는 primer를 제작하였다. Primer의 sequence는 아래와 같다.

Forward primer 5’CATATGCGTATCGATTCAGCCGC-3’

Reverse primer 5’-AAGCTTTACTTGTACAGC-3’

728x90

그 후, 그 다음으로 큰 volume인 27.5㎕의 DIW를 넣고 forward primer와 reverse primer를 10㎕씩 넣는다. 그리고 제일 작은 volume의 2.5㎕ template DNA를 넣는다. 만든 PCR mixture에서 20㎕만큼 4개의 PCR tube에 넣는다. 원심분리를 짧게 시키고 tube의 겉면에 용액이 없는지 확인한다. Tube들에 들어간 mixture volume이 같은지 육안으로 확인하고 PCR기계에 넣고 PCR조건과 반응volume확인 후에 시작한다. PCR조건은 아래의 표와 같다. 아래의 조건으로 25cycle을 진행한다.

 

온도(℃)	시간	온도(℃)	시간
94	3분	72	50초
94	30초	72	2분
50	30초

1시간 후 PCR이 완료되면 PCR product를 4에 둔다. PCR tube를 꺼내서 보관할 경우 냉장고에 둔다.

 

PCR이 완료되면 이를 가지고 전기영동을 진행한다. 먼저 삼각플라스크에 agarose 0.5g을 넣고 1X TAE 50㎖을 넣어 1% agarose gel을 만든다. 그리고 삼각플라스크의 입구부분을 비닐로 감싼 후에 작은 구멍을 내고 전자레인지에 넣어 2분간 돌린다. EtBr을 5㎕만큼 넣은 후에 흔들어서 섞어준다. Gel box에 붓고 30분 간 굳히고 사용할 부분만큼을 잘라준다. 그리고 전기영동기계에 넣은 후에 gel이 덮이도록 1X TAE buffer를 붓는다.

 

Well의 가장 왼쪽에 DNA ladder를 10㎕만큼 넣어주고 PCR을 마친 PCR sample을 spin down으로 용액을 모으고 20㎕만큼 well에 로딩해준다. 전기영동기계는 30분동안 180volt로 설정하고 기포가 올라오는 것을 확인하고 전기영동이 완료되면 loading dye인 bromophenol blue와 xylene cyanol이 제대로 위치하는지를 확인하고 UV lamp를 켜서 샘플의 DNA 밴드를 확인하고 왼쪽의 DNA ladder를 통해서 사이즈를 파악한다. 그리고 맞는 DNA를 UV lamp를 킨 상태로 DNA가 포함되게 조각으로 자른다. DNA gel조각을 e-tube에 넣고 500㎕의 GB buffer넣은 후에 녹도록 10분간 50℃ water bath에 담가둔다.

 

이 때 3분간격으로 tapping을 통해서 DNA gel slice와 buffer가 섞이게 한다. 10분 후 다 녹았다면 용액을 spin column에 넣고 1분간 12000rpm에서 원심분리한다. 그리고 flow thro㎍h는 버리고 다시 column에 NW buffer를 750㎕을 넣고 5분간 놔둔다. 그리고 동일조건에서 원심분리하고 flow thro㎍h를 버린다. 그리고 마지막으로 빈 spin column을 앞과 동일한 조건에서 원심분리한다. 원심분리 후에 spin column을 새로운 e-tube로 옮기고 10㎕의 elution buffer를 넣고 2분간 스탠딩한다.

 

이후에 12000rpm에서 1분간 원심분리하고 새로운 e-tube에 loading dye 1㎕과 정제된 샘플 3㎕을 넣어주고 이를 전기영동기계에 로딩한다. 또한 4㎕의 DNA ladder도 걸어준다. 30분 간 180볼트에서 전기영동을 시켜주고 loading dye의 위치를 확인한 후에 UV lamp를 켜서 걸어준 DNA의 밴드를 확인한다.

 

 

 

[분자생물학실험]Competent cell을 통한 형질전환효율 측정 그리고 PCR product의 전기영동 레포트