BSA를 이용하여 단백질 농도의 표준 곡선을 그리고 분광광도계를 이용하여 우유의 희석률에 따른 흡광도를 측정한 다음 BSA 표준 곡선을 이용하여 우유를 희석시킨 용액에 포함된 단백질 농도를 알아낸다.
분광광도계
광원에서의 빛을 모노크로미터에 의해 단색화 하여 시료 용액에 투과시켜 투과광의 강도를 전기신호로 변환하여 시료의 흡광도를 측정하는 장치로 일반적으로 단색광을 얻는 장치와 이 단색광의 세기를 정량적으로 측정하는 장치로 이루어져 있다.
Bradford Assay
단백정량을 위한 대표적인 방법 중 하나로 여러 가지 농도의 BSA를 만들어 발색시약을 넣은 후 반응시켜 595㎚에서 흡광도 측정을 한다. 그런 다음 표준 곡선을 그리고 미지 시료의 흡광도를 측정하여 그 값을 BSA와 비교하여 시료의 농도를 알아낸다.
단백질 농도 측정을 위한 표준 곡선
미지 시료의 단백질 농도를 측정하기 위해서는 농도를 알고 있는 단백질 용액을 이용해 표준 곡선을 그려야 한다. 표준 곡선의 x축은 BSA의 농도, y축은 BSA농도에 따른 흡광도로 그린다. 표준 곡선이 완성되면 미지 시료와 BSA를 비교하여 미지 시료의 단백질 농도를 측정할 수 있다.
실험 방법
1. BSA 표준 곡선 그리기
1) 한 세트에 7개씩, 두 세트의 EP-tube에 0, 3, 6, 12, 25, 50, 100을 라벨링한다.
2) 7개의 EP-tube에 각각 0, 3.12, 6.25, 12.50, 50.00, 100.00㎍/㎖의 BSA 용액을 제작하여 넣는다. 이때 각 EP-tube 속 용액의 부피는 300㎕가 되도록 한다.
3) 2)의 과정을 반복하여 2세트를 제작한다.
4) 각 EP-tube에 bradford를 200㎕씩 넣고 voltexer를 이용하여 섞는다.
5) 96 well plate의 뚜껑에 0, 3, 6, 12, 25, 50, 100을 라벨링한 후 각 EP-tube에서 200㎕씩 취하여 옮긴다.
6) 분광광도계를 이용하여 595㎚에서 흡광도를 측정한다.
7) x축은 BSA의 농도, y축은 BSA농도에 따른 흡광도로 BSA 표준 곡선을 그린다.
2. 우유를 희석한 용액의 단백질 농도 추정
1) 한 세트에 5개씩, 두 세트의 EP-tube에 1, 1/10, 1/30, 1/100, 1/300을 라벨링한다.
2) 5개의 EP-tube에 각각 우유를 300, 30, 10, 3, 1㎕씩 넣고 각 EP-tube 속 용액의 부피가 300㎕가 되도록 남은 부분을 증류수로 채워준다.
3) 2)의 과정을 반복하여 2세트를 제작한다.
4) 각 EP-tube에 bradford를 200㎕씩 넣고 voltexer를 이용하여 섞는다.
5) 96 well plate의 뚜껑에 1, 1/10, 1/30, 1/100, 1/300을 라벨링한 후 각 EP-tube에서 200㎕씩 취하여 옮긴다.
6) 분광광도계를 이용하여 595㎚에서 흡광도를 측정한다.
7) 표준 곡선을 이용하여 우유를 희석한 용액의 단백질 농도를 측정한다.
[일반생물학실험]Macromolecules - Protein Quantification.hwp 레포트
1. 실험 목적 1.1. 해결 과제 BSA를 이용하여 단백질 농도의 표준 곡선을 그리고 분광광도계를 이용하여 우유의 희석률에 따른 흡광도를 측정한 다음 BSA 표준 곡선을 이용하여 우유를 희석시킨 용
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