분자생물학실험 | 6X His tagged eGFP 단백질의 정제와 분석

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

재조합 단백질(6X His tagged eGFP)의 발현과 정제를 위한 실험이다.먼저 GFP 발현하기 위해서 첫번째로 BL21 inoculation을 진행한다. 균을 다루는 실험(접종/배양)에서는 오염 방지를 위해 알코올 램프 위에서 진행한다. LB 5㎖을 시험관에 넣고, 여기에 Kanamycin 5㎕을 넣어준다. Loop를 살균하고 plate 뚜껑에서 식힌 후에 미리 spreading 해둔 BL21 plate(pET28a::egfp)에서 colony를 pick한다. BL21 inoculation completed라고 라벨링을 한 후에 37℃ shaking incubator에서 배양액에 공기의 공급이 잘 되게 튜브를 비스듬히 넣고 Overnight cultivation시킨다.

 

다음날 실험 당일 오전에 넣어둔 시험관을 꺼낸다. Kanamycin 400㎕을 autoclaved된 400㎖ LB에 넣어주어 사용하는 pET28a(+)plasmid가 kanamycin 저항성을 가지게 한다. 밤새 배양한 BL21 4㎖을 LB 400㎖(Kana R)에 넣어준다. O.D 595㎚ 측정을 위해 LB(blank) 1㎖과 c㎕tured sample 1㎖ 준비하고 Cuvette에 LB를 넣어 blank 설정한다. 그리고 꺼낸 후에 Cuvette에 sample을 넣어 측정한다. O.D(optical density)가 595㎚ 파장에서 0.4～0.5 사이가 되도록 2시간 가량 배양한다. 이 때 exponential state가 induction을 통해 단백질을 발현시키기에 가장 좋다. 배양 후는 배양 전보다 혼탁해진 것을 확인 할 수 있다.

 

IPTG를 이용해 induction하기 위해 1M IPTG 400㎕을 배양액에 넣어줘 GFP 단백질을 인위적으로 induction 시킨다. 5시간동안 37℃ shaking incubator에서 배양하여 단백질이 충분히 발현될 시간 준다. 그리고 Cell pellet 얻기 위해 Centrifuge 전에 sample간 균형을 맞춘다. 본 실험에서는 3개의 centrifuge tube로 저울 이용한다. 나사를 잘 고정한 뒤에, tube size에 맞춰 넣는다.Centrifuge를 6000rpm 15분 4℃ 조건으로 돌린다.

 

이때, 고장의 위험이 크기 때문에 RPM의 상승을 충분히 지켜본다. Centrifuge 완료 후에 초록 형광을 띠는 pellet 확인하고, 상층액을 제거해 pellet만 얻는다. 얻은 pellet에 sonication buffer를 각각의 bottle에 13.3㎖씩 첨가하여 pellet을 wash한다. 덩어리가 없도록 충분히 voltex시키고 Cell down을 하기 위해서 모두 모아서 50㎖ conical tube로 옮긴다.

 

만약Bottle에 잔류하는 세포가 존재하면 pipetting 등으로 모두 옮긴다. Centrifuge전에 sample 간 balance 맞추고 4000rpm 15min 4℃에서 centrifuge시킨다. Centrifuge 완료 후에 tube를 꺼내고 초록 형광의 pellet 확인하고, 상층액을 제거해 cell pellet만 얻는다. 단백질의 변성을 최소화 하고자 실험 중간 얼음에 보관하도록 한다. Pellet tube에 BL21 pET28a::eGFP로 라벨링하고, 정제 전까지 펠렛을 -80℃ defreezer에서 보관한다.

 

GFP를 정제하기 위해 cell sonication 과정을 거친다. 세포 분쇄 및 단백질 정제 진행을 위해 defreezer에서 cell pellet 꺼낸다. 얼었던 pellet이 얼음에서 어느정도 녹으면, Sonication buffer 40㎖을 넣어주고 100mM PMSF(protease inhibitor) 400㎕을 넣어준다. Sonication이 잘 일어나도록 뭉친 덩어리가 없는지 확인하며 Voltexing을 통해 cell을 resuspension 시킨다. 용액을 빛에 대보며 골고루 풀렸는지 확인한다. Sonicator와 chamber(소음방지)의 기기조작방법은 먼저 setting에서 400W, total time 4min, 1sec sonication/1 sec rest로 설정한다. 그리고 사용전에 용액에 닿는 부분인 node를 EtOH와 DIW로 부드럽게 세척한다. Sonication시 열이 나기 때문에 단백질 변성을 막고자 얼음에 꽂고 진행한다.

 

그 후, 용액이 node에 적정한 높이로 잠기도록 고정하고 진행(너무 깊거나 얕으면, 거품이 나거나 sonication이 잘 되지 않음)한다. 갈리는 듯한 소음이 발생하면 sonication이 잘 이뤄지고 있는 것이다. 4분이 지난 뒤, tube를 꺼내서 전보다 혼탁도가 낮아지고 투명해져서 cell이 잘 깨졌는지 확인한다.그렇지 않은 경우에는 sonication을 더 진행하여 cell을 충분히 깨줘야한다. 사용 후에는, 사용 전과 마찬가지로 닦아주고 정리한다.

 

Centrifuge 전, sample 간 균형을 저울을 이용해 맞추어준다. Centrifuge의 이유는 깨진 세포벽/막 등의 불순물을 pellet으로 가라앉히고 단백질 GFP가 용해된 용액만을 얻어내기 위함이다. 4000rpm,10min,4℃에서 centrifuge한다. Centrifuge가 끝나길 기다리는 동안, resin(Ni-NTA agarose)을 wash하여 준비한다. Resin stock 1㎖을 e-tube에 넣는다. Resin은 잘 가라앉기 때문에, 흔들거나 pipetting 하는 등의 방법으로 충분히 resuspension하여 사용한다.

 

이것을 2000rpm에서 5min centrifuge한다. Resin 입자와 buffer 간 층 분리를 확인하고, 상층액(Resin 보관 buffer)를 제거한다. Sonication buffer 500㎕을 넣어 resuspension시킨다.이는 Sonication buffer와BL21가 섞인 cell과 조성을 맞추고자 잔류 ethanol을 wash하는 것이다. Pipetting 시, resin이 팁에 묻지 않도록 유의하며 resin을 골고루 resuspension시키고 다시 2000rpm 5min으로 centrifuge한 뒤, 상층액 제거한 후 sonication buffer 500㎕로 resuspension한다.그리고 15㎖ conical tube에 넣는다.

 

Resin 준비하는 동안 resin protein binding을 위해 끝난 centrifuge에서 tube를 꺼낸다. Pellet 색이 이전보다 초록빛을 덜 띠면 cell이 잘 깨진 것이다. 단백질(GFP)이 녹아있는 상층액(맑은 형광빛 GFP sample 용액)만을 따로 모은다. 상층액(GFP 용액)을 그대로 사용하지 않고, 이후 실험에 쓰기 위한 적정한 농도의 GFP를 만들기 위해 Sample 20㎖+sonication buffer 20㎖를 섞어 1/2로 dilution해서 사용한다. 1인 기준으로, 10㎖의 sample과 준비해둔 resin을 반응시킨다. Resin을 완전히 사용하고자, 용액을 따서 resin이 담겨있던 e-tube에서 pipetting 한 뒤 다시 15㎖ conical tube로 옮기고, GFP가 resin에 잘 binding할 수 있도록 cold room의 rocker에서 1시간 동안 반응시킨다.

 

Protein elution을 위해 먼저 Sample+resin 용액을 모두 column에 붓고, Column 밑에 15㎖ conical tube를 두고 flow through(FT)를 받는다.Column에서 FT용액이 모두 빠지면 wash buffer 5㎖을 column 벽면을 따라 넣어서, resin이 움직이지 않도록 유의하면서 resin을 1차적으로 wash한다. 1차 wash가 완료후에, 5㎖ wash buffer로 2차 wash 진행한다. 1차 ,2차 wash가 모두 끝나면, elution된 GFP를 받을 e-tube를 준비하고 Elution buffer 5㎖을 넣어준다. 그리고 각 e-tube에 5방울씩 받아준다.이것은 색을 관찰하여 높은 농도의 GFP가 elution된 tube만 사용하기 위함이다.

 

경과에 따라, 점차 GFP가 고농도로 포함된 노란 빛의 방울이 떨어지며 resin과 GFP의 binding이 떨어져 Resin이 본연의 색을 찾아간다. GFP가 어느 정도 elution된 이후엔, 낮은 농도의 GFP가 포함된 용액이 떨어진다. 좌측 1번을 기준으로 형광 빛이 가장 진한 2,3,4번 tube만을 선택하고 고농도 GFP용액을 담은 2,3,4번Sample을 하나로 모은다.

 

다음은 6x his tagged eGFP의 ultrafiltration와 단백질의 정성적 특성파악(SDS PAGE and spectrophotometer)을 하기 위해 하는 실험이다. eGFP의 정제를 위해 먼저 Amicon centrifugal filter tube를 이용한 단백질 정제 결과물의 ultrafiltration시킨다. Amicon centrifugal filter tube에 DIW 2㎖ 넣고(Tube 용도: 각각 sample정제용과 balance용)4℃ 4000rpm조건에서 5min동안 centrifugation한다.

 

이 때 Tube의 filter 방향에 유의하여 꽂기. Centrifuge가 끝나면 filter 밑으로 DIW가 빠진 것 확인하고 Amicon centrifugal filter tube prerinsing을 끝낸다.Tube에 들어있는 DIW를 제거하고 7주차에 얻은 단백질 정제 결과물을 모두 amicon centrifugal filter tube로 옮기고 Sonication buffer를 추가해 총 5㎖로 맞춰준다. Centrifugation 전, 균형을 맞추고 Filter 방향에 유의하며 4℃, 4000rpm조건에서 15분동안 centrifugation한다.

 

Centrifuge가 끝나면 filter 밑으로 용액이 빠진 것 확인하고 Filter 밑으로 빠진 용액을 제거한다. (2개)Amicon centrifugal filter tube에 2㎖의 sonication buffer 넣어 불순물(imidazole)을 희석한다.동일하게 Filter의 방향에 유의하며 4℃ 4000rpm 조건에서 20분 동안 centrifugation(2개)하고 Centrifuge가 끝나면 용액이 filter 밑으로 빠진 것 확인한다.

 

Sonication buffer 2㎖을 넣어 4℃ 4000rpm 조건에서 20분 동안 centrifuge하는 불순물 희석과정을 총 3회 진행한다. Filter 위에 남은 eGFP 용액을 모두 새 e-tube로 옮긴다. e-tube 내 용액의 최종 volume이 1㎖이 되도록 Sonication buffer 넣는다.( eGFP를 최대한 모으기 위해 buffer를 filter 위에 첨가한 뒤에 e-tube로 옮김) 해당용액에 100mM PMSF 10㎕ 첨가한다. 그리고 4℃에 보관한다.

 

eGFP의 확인하기 위해 UV/VIS spectrophotometer를 사용한다. Spectrophotometer를 이용해 eGFP의 흡광도 측정하기 위해 먼저 하나의 석영 cuvette에 sonication buffer 1㎖(blank)을 넣는다. 1/10으로 eGFP를 희석시키기 위해 새 e-tube에 sonication buffer 900㎕과 eGFP 정제 결과물 100㎕을 섞어준다. 다른 하나의 cuvette에 1/10으로 희석한 단백질 정제 결과물 1㎖을 넣는다. Spectrophotometer 사용 설정방법은 전원을 켜고 시작화면이 로딩될 때까지 기다린다.

 

주요기능 검사가 완료되었다는 멘트가 나오면 시작화면으로 전환되기를 기다린다. 시작화면으로 완전히 전환되면, SUR(survey scan mode)를 누르고 설정메뉴가 뜨기를 기다린다. 설정 조건은 이름은 survey scan mode(SUR)로 New SUR, 셀타입은 single cell, 시작파장은 250, 종료파장 ,600단위파장(파장 간격) 1㎚로 설정한다. 250에서 600㎚ 파장범위에서 흡광도를 측정하는 이유는 eGFP가 높은 흡광도를 보이는 280㎚와 488㎚에서 흡광도를 측정하여 이후 eGFP 시료의 농도를 계산하기 위한 것이다. 설정이 완료되면, 먼저 Blank cuvette을 넣어 baseline 측정한다(Cuvette을 넣을 시 빛 진행 방향에 유의하여 넣기). Baseline 설정이 완료되면, blank cuvette을 꺼내고 sample cuvette을 넣어 측정한다.

 

SDS PAGE 전개를 위한 sample 준비하기 위해 각각 sonication 후 얻은 whole cell lysate와 단백질 정제 결과 Sample 6㎕과 B-mercaptoethnaol을 포함하여 protein의 disulfide band를 끊어주는 기능을 하는 2X SDS gel loading buffer(laemil’s buffer) 6㎕를 섞어준다. 철제 rack에 준비된 sample tube들을 고정하여 끓는 물에서 5분 간 가열하여 단백질의 3차구조를 파괴한다.

 

5분 뒤, 가열된 sample tube를 조심히 꺼낸다.그리고 SDS PAGE 전개를 위한 module 조립 및 tank 준비 과정은 먼저 전기영동을 위한 SDS PAGE gel module 조립하고 Polyacrylamide gel과 유리판을 고무부분에 잘 밀착시켜 끼운다. 이는 Buffer가 module 외부로 새지 않도록 하기 위함이다. 유리판과 gel이 완전히 밀착되면, module을 틀에 끼워 고정시키고, Module이 완성되면 tank에 넣어 고정시킨다.그리고 1X Running buffer 500㎖(10X Tris-glycine 50㎖+SDS 5㎖+DIW445㎖) 을 부어준다.

 

이 때, SDS는 Detergent로써 protein을 denature시킨다. Module의 안쪽 부분에 buffer가 가득 차도록 하고, module의 바깥공간에는 buffer를일부만 채워도 된다. Sample loading 방법과 SDS PAGE 전개방법에서는 먼저 protein ladder(marker)를 5㎕ loading하는데 sample이 well에 잘 쌓이는지 확인하며 천천히 첨가한다.

 

이후 eGFP sample(whole cell lysate와 단백질 정제 결과물)을 각각 12㎕씩 loading한다. 잘 loading 되었는지 확인해준 뒤, 빈 well이 없도록 남은 well들에 각각 1X lae㎖i’s buffer 12㎕첨가해주면, sample 간의 인력으로 전개 시 band가 곧게 내려간다.그리고 120V로 약 15분 전개하는데 tank 윗부분 전극에서 기포가 올라오는 것 확인한다.

 

Stacking gel의 경계까지 sample이 내려가면, 150V로 전압을 올려 Sample이 유리판 끈까지 내려갈 때까지 기다리고 마찬가지로 tank 윗부분에 기포가 올라오는 것 보고 전류가 흐르는 것을 확인한다. Sample이 gel 맨 아래에 도달하면, 전원을 끄고 뚜껑을 열어 전극을 분리한 뒤 running buffer를 tank에서 제거한다.

 

SDS PAGE가 완료된 gel을 취하여 staining하기 위해 먼저 Tank에서 module을 꺼내서 gel 유리판을 분리하고 두 유리판의 틈을 벌려, 그 사이에 위치하는 polyacrylamide gel만을 취한다. Gel은 매우 얇고 부드럽기 때문에 유리판에서 GEL을 분리할 때는 gel이 찢어지지 않도록 유의해야 한다. 그리고 Band 가 존재하지 않아 불필요한 stacking gel 부위는 잘라서 제거한다.

 

남은 resolving gel부분을 staining solution(Comassie blue)이 담긴 플라스틱 용기에 담가 Gel이 접히지 않고 잘 펴서 solution과 고루고루 반응하도록 한다. 그리고 이 해당 gel을 rocker에서 실온 2시간 조건으로 반응시킨다. Gel destaining방법과 protein band의 확인을 위해 2시간의 staining이 끝나면 staining buffer를 제거하고 Destaining buffer를 넣고 rocker에서 실온 overnight 반응시킨다.

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Overnight destaining 후, buffer를 제거하고 band 모양을 확인한다. 만약 25kDa 근처에서 band가 관찰되면 이는 eGFP HisX6의 size이다. Whole cell lysate에서는 target- protein뿐만 아니라 다른 size의 Protein도 검출된다.ultrafiltration sample에서는, target protein만이 더 선명하게 검출된다.

 

1-6까지는 BSA standard curve를 위한 시료가, 7,7’,7’’는 GFP sample이 들어있는 24well plate의 모식도.

 

마지막으로 EGFP의 정량 및 확인을 위한 실험을 진행한다.

 

번호	DIW(l)	BSA stock(l)	Final concentration(㎎/㎖)
1	500	0	0
2	490	10	0.02
3	480	20	0.04
4	470	30	0.06
5	460	40	0.08
6	450	50	0.1

표 1.  24 well plate에 넣는 농도별 BSA의 조성

 

번호	DIW(l)	GFP(l)	Final concentration(㎎/㎖)
7,7’,7’’	496	4	0.008

표 2. 24well plate에 넣는 샘플의 GFP 조성

 

Lowry assay를 이용한 단백질 정량하기 위해 먼저 Sample을 만든다. 24 well plate에 위의 표와 같이 sample을 넣어준다. 1번 well은 blank로 분석물이 들어있지 않고 DIW만 들어있다.먼저 위쪽 1-7 well에 BSA를 통한 표준곡선을 그리기 위해 BSA농도를 다르게 넣고 아래의 7well에 eGFP sample을 넣어준다. 이 때 3개의 sample을 준비하여 평균을 내줄 것이다.

 

표에 맞추어 각 well에 loading하기 위해 1-6well에 DIW를 넣어준다. 먼저 DIW 500㎕를 1번 well에, DIW 490㎕을 2번 well에 ,DIW 480㎕을 3번 well에 ,DIW 470㎕을 4번 well에 ,DIW 460㎕을 5번 well에, DIW 450㎕을 6번 well에 넣어준다.

 

다음으로 BSA(1㎎/㎖)를 각 well에 넣어준다. 먼저 BSA(1㎎/㎖) 10㎕를 2번 well에 넣고, pipetting으로 단백질이 잘 섞이도록 해준다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의한다. BSA(1㎎/㎖)20㎕를 3번 well에, BSA(1㎎/㎖)30㎕를 4번 well에, BSA(1㎎/㎖)40㎕를 5번 well에 ,BSA(1㎎/㎖)50㎕를 6번 well에 넣는다.

 

다음으로 eGFP sample은 넣는다. DIW를 7번 well들에 496㎕씩 넣어준다.그리고 정제한 eGFP 4㎕를 각 7번 well들에 넣어준다. Biuret reaction을 위해 solution A를 넣어주는데 각 sample에 250㎕씩 조심스럽게 넣어준다. 또, Folin reaction을 위해 solution B를 각 well에 2㎖씩 넣어준다. 피펫팅을 이용해 섞어줄 때 버블이 생기지 않도록 조심한다.

 

뚜껑을 닫아 호일로 잘 싸서 15분 동안 반응 시켜주고, 15분 기다리는 동안 spectrophotometer 설정을 한다. Spectrophotometer의 기기설정을 한다. 프로그램이 켜지면 create protocol을 눌러주고 create new를 눌러준다. 750㎚에서 흡광을 측정하기 위해 absorbance를 누르고 Wavelength는 750㎚로 설정한다. 24well general을 설정하고 Measurement를 추가한다. 그리고 No data analysis를 누르고 측정하려는 well들을 선택한다.(1줄 모두 선택, 3줄의 1,2,3번 측정)

 

Protocol name을 eGFP Lowry assay로 설정한 후 protocol이 저장되어 있는 것을 확인한다. 15분 후에, BSA의 농도에 비례하여 파란 빛이 진하게 나타난다. 흡광도 측정을 위해 24well plate의 뚜껑을 벗겨 옆면을 잡아 기계에 올려준다.설정한 protocol을 이용해 흡광도를 측정하면, BSA농도에 비례하여 흡광도 값이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그리고 아래의 eGFP의 흡광도가 비슷하게 측정된 것을 확인 할 수 있다.

 

이 값들을 이용해서 BSA standard curve를 그리고 standard curve를 이용하여 eGFP의 농도를 구할 수 있다. 측정이 끝나면 24well plate를 꺼내어 마무리 해준다. 그리고 측정할 eGFP 농도를 이용하여 다음 실험에서 사용할 sample 500㎕(0.02 ㎎/㎖)가 되기 위한 eGFP의 양을 계산하여 준다.

 

Flourophotometer를 이용한 eGFP의 excitation, emission 파장을 확인하기 위해 Spectrofluorometer를 이용한다. 먼저 Sample 만드는데, 24 well plate well 하나에 sonication buffer 1㎖를 넣고 구한 값인 3.88㎕만큼 buffer를 덜어준다.(농도 맞추기 → 0.02㎎/㎖) 그리고 eGFP를 3.88㎕만큼 다시 넣는다.(농도 맞추기 → 0.02㎎/㎖)

 

Spectrofluorometer의 protocol을 설정한다.Create new를 누르고 Fluorescence intensity로 설정한다. Exc wavelength는 490㎚, Ems wavelength는 510㎚를 입력한다. 24 well general을 선택하고 Spectro scan measurement를 두번 추가한다. Emission scan에서 파장구간을 최소 490㎚ 최대 550㎚으로, step을 0.25㎚로 바꾸어 준다.

 

또한 Excitation wavelength는 470㎚로, Excitation scan에서의 파장구간을 최소 450㎚ 최대 510㎚으로 설정하여 준다. Step은 0.25㎚로 설정하고 emission wavelength를 530㎚로 설정하고 No data analysis를 누른다. 측정하고자 하는 well을 하나 선택하고 protocol name을 설정해 준다. (eGFP spectro flurometer)

 

그러면 설정한 protocol이 저장된 것을 확인 할 수 있다. 그리고 Fluorescence 측정을 위해 24 well plate를 기기 위에 올려주고 뚜껑을 열어준다. 설정한 protocol을 이용해 fluorescent를 측정하면 그래프가 그려지는 것을 확인한다.(Emission scan)

 

 

 

[분자생물학실험]6X His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제와 단백질의 정량 및 정성적 특징 확인 레