일반생물학실험 | Photosynthesis

 

 

 

TIP

 

 

식물세포 소기관의 추출법을 익히고 광합성에서 광분해와 전자전달, 그리고 산소 발생의 원리를 이해한다.

 

 

 

R. Hill과 그의 동료들은 광합성에서 산소의 발생이 이산화탄소의 고정과는 분리되어 일어날 수 있음을 밝혔다. 그들은 잎으로부터 엽록체를 분리하여 빛을 쪼여주면 외부에서 제공한 전자 수용체가 환원됨을 알아내었고, 전자의 궁극적인 공여체는 물임을 밝혔다. 온전한 잎에서는 물에서 나온 전자를 ferredoxin, NADP, 그리고 마지막으로 3-phosphoglyceric acid가 받아들이게 되지만 Hill의 실험에서는 엽록체를 분리했으므로 이러한 전자수용체가 결여되게 된다. 그래서 자연적인 전자수용체 대신에 2,6-Dichlorophenol indophenol (DCPIP)과 같은 화학물질을 전자수용체로 첨가한다. DCPIP는 산화된 상태(Quinone form)에서는 파란색을 띠지만 환원되면 색깔이 사라진다.

 

 

이러한 원리로 DCPIP의 푸른색이 없어지는 정도로 분리된 엽록체로부터의 산소발생율을 측정할 수 있다.

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실험 방법

실험 1 엽록체의 분리 : 엽록체 현탁액은 미리 준비

1) 다음의 모든 실험은 저온에서 수행한다.

 

2) 깨끗한 시금치 4g을 저울에 잰다.

 

3) 가위로 작은 조각으로 자르고 15 ㎖의 찬 phosphate 버퍼에 담근다. 깨끗한 sea sand를 소량 첨가한 후에 약 2분간 냉동된 막자사발에서 조직을 골고루 간다.

 

4) 냉장된 거즈를 8겹으로 만들어 시금치 파쇄액을 거른다. 이때 여과액은 바로 냉장보관 원심관에 넣는다.

 

5) 400g에서 여과액을 1분간 원심분리한다. 원심관은 반드시 대각선 방향으로 무게 균형을 맞춘 후 원심분리한다.

 

6) 원심분리 후 상징액을 다른 깨끗한 차가운 원심관으로 옮긴 후 4℃, 1000g에서 다시 5분간 원심분리한다.

 

7) 원심분리 후 상징액을 버리고 밑부분에 가라앉은 펠렛을 10㎖의 찬 phosphate 버퍼에 현탁시킨다.

 

8) 3 ㎖의 엽록체 현탁액을 깨끗한 차가운 시험관에 옮긴 후 6㎖의 찬 phosphate 버퍼를 첨가한 후 골고루 섞는다. 이것이 광합성의 Hill 반응에 사용할 엽록체 현탁액이다 ⇒ 냉장 보관/장기간 보관시 –20℃보관

 

실험 2. 엽록체의 관찰

1) 현미경을 이용, 분리한 엽록체의 구조를 관찰한다.

 

2) 슬라이드글라스에 한 방울의 엽록체 현탄액을 떨어뜨리고 기포가 들어가지 않게 주의하여 커버글라스를 덮은 뒤 100X∼400X로 관찰한다.

 

 

실험 3. Hill 반응에 대한 광합성 결과로써의 전자전달 관찰

엽록체는 thylakoid membrane에서 물로부터 온 전자를 NADP⁺에 전달하여 NADPH를 만든다. 이 NADPH는 캘빈회로에서 CO₂ 를 포도당으로 만드는 효소로써 사용된다. 그러나 이 실험에서 엽록체를 분리하는 과정 중에 NADP⁺ 같은 전자수용체가 분리되었으므로 DCPIP라는 화학물질을 전자수용체로 첨가하여 빛으로 촉진되는 전자전달과정을 관찰할 것이다. DCPIP는 원래 산화된 상태로 푸른색을 띠나, 환원되었을 때에는 무색으로 변한다.

1) 시험관 하나를 두 겹의 알루미늄 호일로 감싸고 “A”라고 표시한다.

 

2) 다른 시험관에 “B”라고 표시한다.

 

3) 두 시험관에 2.5㎖의 phosphate 버퍼를 넣는다.

 

4) 두 시험관에 200ul의 0.5mM DCPIP 용액을 넣는다(최종 농도 500uM).

 

5) 두 시험관에 2.3㎖의 H₂0를 넣는다.

 

6) 두 시험관에 100㎕의 엽록체 현탄액을 넣는다.

 

7) “B" 시험관을 밝은 광원(현미경 광원 최대 밝기 등) 앞에 30초∼2분정도 노출시킨 뒤 색이 푸른색에서 무색으로 변하는 것을 관찰한다. ”A“ 시험관과 비교하여 색의 변화를 관찰하도록 한다.

 

 

 

[일반생물학실험]Photosynthesis 레포트