일반생물학실험 | Observation of Microorganism using Grams Stain Method - 그람염색법을 이용한 미생물의 관찰

 

 

 

TIP

 

 

고체배지에서 배양한 미생물에 그람염색법을 이용하여 염색한 뒤 현미경으로 배양시 킨 미생물을 관찰해보자.

 

 

 

그램 염색법은 각종 검체 및 배양집단의 현미경적 검사에 이용되며 미생물에 의한 감염여부를 조기에 진단할 수 있게 해준다. 그램 양성균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teicoic acid로 이루어져 있어서 organic decolorizer(탈색제)로 탈색 시 쉽게 탈색되지 않으며 따라서 염색액 crystal violet이 계속 세균내에 남아있어서 보라색으로 염색된다. 그램 음성균은 peptidiglycan layer가 단일충으로 되어있으며 세포벽은 지방성분이 풍부한 lipopolysaccharide(LPS)로 이루어져 있어 탈색제에 의해 crystal violet이 쉽게 탈색된다. 따라서 대조 염색액인 safranin O로 염색되어 붉은색을 나타낸다.

 

그램 염색의 결과를 여러 가지 방법으로 설명할 수 있다. 그램 양성균과 그램 음성 균은 기본적으로 세포벽의 물리적인 특성이 서로 다르다. 그램 양성균에서 세포벽을 제거하면 그램 음성 균처럼 염색된다. 펩티도글리칸 자체가 염색되는 것은 아니고 그램 양성균의 두꺼운 펩티도글리칸 층이 크리스탈 바이올렛이 제거되는 것을 막는 것으로 생각된다. 그램 염색을 할 때 먼저 크리스탈 바이올렛으로 세균을 염색한 다음 요오드를 처리하여 염료가 잘 부착되어 있도록 한다.

 

그 다음 에탄올로 탈색하면 그램 양성균에서는 알코올이 두꺼운 펩티도글리칸을 수축시키면서 염료가 빠져나갈 수 있는 구멍을 막아버리는 것으로 생각된다. 그러므로 요오드와 결합한 염료가 짧은 탈색과정에서 빠져나가지 못하고 보라색을 유지하는 것이다. 반면, 그램 음성 균의 펩티도글리칸 층은 아주 얇고 중간 중간에 연결된 부분이 적으므로 분자 사이에 더 큰 구멍이 뚫려 있다.

 

알코올을 처리하여 지방성분을 제거하면 그램 음성균 세포벽의 구멍은 더 커진다. 이런 이유로 알코올은 그램 음성 균에서 크리스탈 바이올렛-요오드 복합체를 쉽게 제거할 수 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 슬라이드 글라스 위에 증류수를 한 방울 떨어뜨린다.

 

2) 배양된 균을 이쑤시개 끝으로 떠서 슬라이드 글라스 위의 증류수에 잘 푼다.

 

3) Crystal Violet 염색액을 가하고 약 1분간 반응시킨다.(염색)

 

4) 2초∼5초 정도 증류수로 washing 을 한다.

 

5) 95% 에탄올을 가한다음 45초 정도있다가 증류수로 2초∼5초간 washing 을 한다. → 지방질 용해(탈색)

 

6) Safranin 용액을 가하고 약 1분간 염색한다.(대비염색)

 

7) 마지막으로 2초∼5초간 washing 을 한번 더 하고 공기 중에서 건조시킨 후 커버글라스 를 덮고 현미경(X400, X1000)으로 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험] Observation of Microorganism using Grams Stain Method 레포트