일반생물학실험 | Genomic DNA 추출 및 PCR

 

 

 

Genomic DNA는 긴 이중사슬로서, 세포의 핵 내에 존재하고 있다. Genomic DNA의 추출은 DNA를 파손시키지 않고, 추출하여 정제도가 높은 DNA를 얻는 것이 중요하며, 정제도에따라 DNA분석에 큰 영향을 미친다. DNA추출 방법 중 하나인 Phenol-Chloroform추출법은 생화학에서 사용되는 liquid-liquid 추출기법이다. 이것은 분자생물학 분야에서 DNA, RNA, 단백질 분리시 많이 사용되는 방법 중 하나이다.

 

각각 같은 양으로 구성되어 있는 페놀-클로로포름 혼합용액에 액체상테의 샘플을 섞어주면, 두 층으로 분리된 혼합용액이 만들어진다. 이 방법은 1987년 Piotr chomczynski와 Nicoletta Sacchi에 의해 처음 고안되었다. 원심분리에 의해 두 층으로 나뉘어진 용액에서 위 층은 수용액상으로 액체상태의 샘플이 있고, 아래층은 주로 클로로포름이 자리잡고 lT다.

 

대부분의 RNA는 위층에 있지만, DNA와 단백질의 일부는 두 층 사이에 있거나, oranic phase에 있기도 한다. 마지막 단계에서 RNA는 2-propanol과 에탄올의 침전에 의해 수용액상으로 분리된다. 페놀과 클로로포름은 유해한 물질이기 때문에 최근에 많은 회사들이 DNA추출을 위한 여러 방법을 개발하고 있다.

 

DNA추출 시 사용되는 여러 종류의 버퍼들에 대해서 알아보면 먼저 TE buffer는 DNA와 RNA 추출에 관계된 모든 분자생물학 실험에서 흔히 사용되는 용액이다. “TE"는 pH buffer로 쓰이는 Tris의 ”T"와 Mg2+와 같은 킬레이트 양이온 분자인 EDTA의 “E"에서 기원하였다. TE buffer의 역할은 DNA와 RNA가 분해되는 것을 막아주는 역할을 한다.

 

두 번째로 Lysis buffer에는 여러 종류가 있는데 이는 실험에 이용되는 세포의 종류에 따라 달라진다. 예로, 적혈구 세포 분석에는 적혈구 lysis buffer가 사용된다. DNA 지문분석시lysis buffer는 DNA분리에 사용되고, 흔히 쓰이는 세제는 DNA가 핵 안에서 빠져나올 수 있도록, 세포막과 핵막을 분해하는 역할을 한다. 세 번째로, Proteinase K는 엔도펩티다아제 K라고도하며, 광범위하게 사용되는 세린분해효소이다. 이 효소는 1974년 균류의 한 종류인 Tritriachium album에서 추출되면서 발견되었다. Proteinase K는 단백질을 분해하거나, 핵산 정제시 발생될 수 있는 오염물질을 제거하기 위해 흔히 사용되는 효소이다.

 

핵산 정제시 Proteinase K를 첨가하게 되면 DNA, RNA purification동안 DNA, RNA를 분해할 수 있는 핵산분해효소를 급격히 불활성화시킨다. 이러한 Proteinase K의 적용은 변성된 단백질, EDTA와 같은 킬레이트화합물, 트립신 또는 키모트립신 억제제와 같은 화학물질이 존재될 때, 효소가 활성화되므로, 매우 적합한 적용이라고 할 수 있다.

 

Proteinase K는 pH 4∼12범위에서 안정한 상태를 가지며, 최적 pH는 7.5∼12이다. 네 번째로, Sodium acetate는 아세트산의 나트륨 염을 일컫는다. 이것은 약산의 짝염기로서 Sodium acetate용액과 아세트산은 pH를 일정하기 유지하기 위해 사용되는 버퍼이다. 이것은 pH에 의존하는 반응에서 매우 유용하게 쓰인다. DNA 추출 마지막 단계에서는 100% 에탄올이 사용되는데 이것은 DNA가 에탄올에 녹지 않는 점을 이용하여 탈수 작용을 일으켜서 DNA를 농축시킴으로써, DNA가 쉽게 추출될 수 있도록 한다.

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실험 방법

1. DNA 추출과정

① 가그린 20㎖을 입에 넣은 후 1분간 입을 헹군다.

 

② 입에 있는 용액을 100㎖ tube에 넣고 labelling을 한다.

 

③ 원심분리시 균형을 맞추기 위해 무게를 잰 후, 동량의 다른 실험자와 함께 2500rpm 에서 10분 동안 원심분리한다.

 

④ 원심 분리 후, 상등액을 제거한다. 이때 pellet이 함께 쏟아지지 않도록 주의한다.

 

⑤ pellet이 있는 튜브에 25㎖ TE buffer를 넣은 후 vortexing하여 pellet을 녹인다.

 

⑥ 같은 양의 샘플을 가지고 있는 실험자와 함께 2500rpm에서 10분 동안 원심분리한 다.

 

⑦ 원심 분리 후, 상등액을 제거한다. 마찬가지로 pellet이 쏟아지지 않도록 주의한다.

 

⑧ 700㎕의 lysis buffer를 첨가하여 pellet을 녹인다.

 

⑨ 700㎕의 lysis buffer가 들어있는 샘플을 1.5㎖ 튜브로 옮긴 뒤 labelling 한다.

 

⑩ 1.5 ㎖ 튜브에 15㎕의 protein kinase를 첨가한 후, 58℃ water bath에서 1시간 동안 incubation 시킨다.

 

⑪ 8000rpm에서 2분동안 원심분리 시킨다.

 

⑫ 샘플 400㎕를 새 튜브에 옮긴 후 labelling한다.

 

⑬ 샘플과 같은 양으로 페놀- 클로로포름 용액을 첨가한 후, 층이 생기지 않을 때 까지 잘 섞어준다. 페놀은 화상을 유발하므로 폴리글로브를 착용하고 실험하여야하며 페놀-클로로포름 용액을 pipetting 시 용액 아랫부분에서 한다.

 

⑭ 1300rpm으로, 2분동안 원심분리한다.

 

⑮ 상등액을 새 튜브로 옮긴 후 상등액과 동량의 페놀-클로로포름 용액을 넣은 후 다시 한 번 13000rpm에서 2분동안 원심분리 한다.

 

⑯ 상등액을 분리 후, 용액 양의 1/10 에 해당하는 3M의 sodium acetate용액을 첨가한 다.

 

⑰ sodium acetate가 첨가되고 난 후, 총 샘플 양의 2배에 해당하는 100% 에탄올을 넣 은 후, -20℃ freezer에서 보관한다.

 

2. PCR 과정

① 4℃ 원심분리기에서 13000 rpm으로 10분 동안 원심분리한다.

 

② 600㎕의 70% 에턴올을 첨가한 후 5분 동안 세척한다.

 

③ desicator에 sample을 넣어 건조시킨 후, 100㎕의 TE buffer를 첨가한다.

 

④ PCR에 사용될 혼합용액을 만든다.

 

⑤ 혼합 용액에 템플릿을 넣은 후 37℃ annealing temperature에서 30cycle로 PCR을 돌린다.

 

 

 

[일반생물학실험]Genomic DNA 추출 및 PCR 레포트