일반생물학실험 | DNA 추출과 전기영동

 

 

 

TIP

 

 

DNA 추출법을 알고, 전기영동의 원리를 이해한다.

 

 

 

DNA 추출

1. Plasmid

세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.

 

2. Plasmisd의 특징

① 복제기점(original of replication)을 갖기 때문에 증식할 수 있다.

② 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)을 가져 selection marker로 사용될 수 있다.

③ Multi cloning site(MCS)가 존재하여 원하는 유전자를 끼워넣을 수 있다.

 

3. 크기 및 형태

① 1kb ∼ 250kb 로, 다양한 크기를 갖는다.

② 고리형태(circular)의 DNA이며, 세포 내에서 대부분의 plasmid는 supercoil형태로 존재 한다.

 

4. Plasmid DNA 분리의 원리(Miniprep)- Plasmid DNA를 소량 분리하는 방법

① Lysozyme + EDTA 세균의 세포벽 분해

② Sucrose 삼투압을 유지하며 세포벽 파열 방지

③ Triton X-100 (mild detergent) 세균의 세포막 분해 용균(cell lysis)

728x90

 

 

실험 방법

1. DNA 추출

1) 박테리아 배양액을 E-tube에 옮겨담아 centrifugation을 1분간 하여 세포를 가라앉힌 후, 상층액은 버린다.

 

2) S1 buffer(세포벽 분해)를 250㎕ 넣어주고, 가라앉힌 세포를 잘 풀어준다.

 

3) S2 buffer(세포막 분해&변성)를 250㎕ 넣어주고, 부드럽게 4번 정도 흔들어 섞어준다.

 

4) S3 buffer(재생)을 350㎕ 넣어주고, 4번 정도 부드럽게 흔들어 섞어준다. 3),4)번 과정에서 심하게 섞지 않는다. (살살 앞뒤로 섞어준다.)

 

5) centrifugation을 10분간 한다.

 

6) 상층액을 조심스럽게 column에 옮겨 담고 30초간 centrifugation한 후, collection tube 에 내려진 용액은 버린다.

 

7) AW buffer 500㎕를 넣고 30초간 centrifugation한 후, colllection tube에 내려진 용액 을 버린다.

 

8) 다시 PW buffer 700㎕를 넣어주고 30초간 centrifugation을, collection tube에 내려진 용액을 버린다.

 

9) 남겨진 wash buffer를 모두 제거해주기 위해, centrifugation을 1분간 더 해준다.

 

10) column만 새 E-tube에 옮긴 후, column의 membrane에 EB buffer 50㎕를 넣어주고 1분간 기다렸다가 centrifugation을 1분간 한다.

 

2. 전기 영동

1) Agarose gel 만들기

① 1× TAE (Tris + acetate + EDTA) buffer에 agarose powder를 1%가 되도록 넣는다.

② 전자레인지를 이용해 agarose를 투명해 질 때까지 완전히 녹여주고 물에 부어 굳힌다.

 

2) sample loading 하기

① gel 틀 1X TAE buffer를 채운 전기 영동 장치에 담근다.

② comb에 buffer가 차도록 해주며 comb에 가까운 방향이 (-)쪽으로 향하게 한다.

③ DNA sample 에 dye를 섞어준다.

④ 첫 번째 comb에 marker를 loading한다.

⑤ 이후로 DNA sample을 loading 한다.

⑥ 50-100V의 전압을 걸어준다.

 

 

 

[일반생물학실험]DNA 추출과 전기영동 레포트