생체재료공학실험 | PEI-DOCA Conjugation

 

 

 

TIP

 

 

PEI-DOCA를 Conjugation하여 micelle을 형성하고 약물이 세포에게 잘 전달될 수 있는지 확인할 수 있다.

 

 

 

Micelle를 이용하여 약물의 생체 이용률을 높이고자 하는 연구가 진행되고 있다. 한 예로, ‘고분자 미셀 약물전달시스템을 이용한 Compound K의 흡수증진 방안에 대한 연구’를 들 수 있다. 위 연구는 인삼의 panaxadiol 계역 사포닌의 새로운 장내 세균 대사체인 20-O-20-protopanaxadiol은 항암작용 및 암전이 억제작용 등 다양한 약리작용을 나타내고, 독성이 적고, 부작용이 적은 천연물로 알려져 있다. 하지만 생체이용률이 낮음에도 불구하고 생체이용률을 높이고자 하는 연구는 아직까지도 부족한 실정이다.

 

이에 Compound K를 고분자 미셀 약물전달시스템을 이용하여 생체이용률을 향상시키고자 하였다. 위와 같이 어떤 물질이나 약물의 생체이용률을 높이기 위해 미셀 약물전달시스템 연구들이 진행되고 있다. 이번 실험에서는 PEI를 세포로 잘 전달하기 위해 쓸개액의 성분인 DOCA를 PEI에 결합 시켜 micelle를 형성한다. PEI는 ‘폴리에틸렌이민’으로 유전자 전달체로서 작용한다. 주로 유전자 전달체로 바이러스를 이용하였지만, 바이러스 감염성의 문제 때문에 바이러스를 대체하여 PEI를 사용하게 되었다.

 

쓸개즙산은 2～4개의 극성기를 갖고 있는 콜레스테롤 유도체이다. 사람의 주요 쓸개즙산은 콜산과 케노디옥시콜산으로 글리신이나 타우린과 결합하여 쓸개즙염을 형성한다. 이 분자들이 모여 미셀이라고 하는 응집체를 이룬다. 비극성기는 미셀의 중앙부에 위치하는 한편, 극성기는 미셀주위의 물과 접촉한다. 소장 속의 레시틴 코레스테롤 및 기타 지질들은 이 미셀에 들어가고 쓸개즙액의 극성 및 비극성 성질로 인하여 지방은 미즙 속에서 유화한다.

 

실험에 사용된 DOCA는 '-OH'기 2개와 '-COOH'기 1개를 가지고 있다. DOCA의 친수성기들은 전체 DOCA분자의 소수성 보다 약하기 때문에 DOCA는 소수성을 띈다. 따라서 DOCA는 소수성 결합을 통해 micelle를 형성한다. 세포는 소수성의 성질 가지고 있다. 만약 PEI에 DOCA를 붙이지 않는 다면 친수성인 혈액속에 녹아 세포에 전달하기 어려울 것이다. 그러므로 DOCA를 붙여 소수성을 갖게하고, 혈액속에서 micelle를 형성하여 PEI가 세포로 잘 전달될 수 있도록 하는 것이 이 실험의 원리이다.

 

 

PEI와 DOCA결합과정은 위와 같다. DOCA의 카르복실기가 PEI의 아민기와 결합한다. PEI는 선형과 가지형으로 2가지 형태를 가지고 있다. DOCA가 PEI에 잘 결합하도록 하기 위해 이번 실험에서는 가지형 폴리에틸렌이민(PEI)를 사용한다.

 

동적 빛 산란(DLS)은 광자 상관 분광법과 준-탄성 광 산란이라고 알려져 있고 용액 동적 검출과 입자크기 측정에 유용한 기기이다. DLS 방법은 몇 분 안에 몇 ㎚에서 약 5㎛ 범위 지름의 입자 크기 정보를 얻을 수 있다. DLS방법은 입자들의 Brown 운동의 결과로서 Rayleigh-산란 빛의 Dopppler 넓힘의 측정과 관련이 있다. 이러한 열적 운동은 산란세기의 시간 변동과 Rayleigh선의 넓힘을 초래한다. Rayleigh선은 Lorentz 선 모양을 갖는다. 거대분자 용액에서는 농토 변동이 지배적이다. 이러한 조건에서 Rayleigh 선 나비는 병진 확산 계수 DT에 정비례 한다. DLS 방법은 광학적 혼합방법과 이러한 계수를 얻기 위한 상호관계의 분석에 이용한다. 그 선 나비는 보편적 분광기와 간섭계조차도 측정하기에 너무 작다.

 

DLS방법은 여러 가지 많은 응용들이 있다. DLS 방법은 중합체 격자와 수지의 입자크기 측정과 에멀전과 중합화 같은 과정 동안에 입자 성장의 측정에 사용된다. 미셀과 마이크로에멀전은 DLS 방법으로 연구된다. 또한 DLS는 생화학 고분자와 생화학 콜로이드의 연구에도 널리 이용한다. 그것은 천연과 합성 폴리펩타이드, 핵산, 리보솜, 막소포, 바이러스, 근육섬유 등의 연구에 사용한다.

 

표면의 물리적 성질에 관한 자세한 정보는 매우 중요하다. 이러한 정보를 얻는 고전적인 방법으로는 광학 현미경을 이용하는 것인데 이것은 현재도 표면의 특성을 연구하는데 중요하게 사용되고 있다. 그러나 광학 현미경법의 분리능은 빛의 파장 주위에서 일어나는 회절 효과에 의하여 제한을 받는다. 전자현미경 분석법 중 하나를 사용하여 보다 놓은 분리능의 정보를 얻을 수 있다. 두 가지 중요한 방법은 주사전자현미경법(SEM) 및 투과 전자 현미경법(TEM)이다. 주사 탐침 현미경법이라 불리는 방법은 주사 터널 현미경법과 원자 힘 현미경법을 특색으로 이루며 중요한 특성 분석방법이다.

 

주사와 투과 전자 현미경법은 서로 비슷한 점을 가지고 있지만, 주사 전자 현미경법은 외향적인 형태구조학의 임지를 제공하며 인간의 눈과 비슷한 결과를 보여준다. 반면에 투과 전자 현미경법은 내부적인 고체 형태를 조사하며 인간의 눈과는 다른 미세구조의 정보를 제공한다.

 

SEM의 영상을 얻고자 할 때, 고체 시표의 표면에 접속된 전자 빔을 부딪치도록 한다. 아날로그 기기에서는 전자 빔으로 주사 코일을 사용하여 시료를 래스터 주사로 직선 주사한다. 래스터 주사 방식은 텔레비전의 음극선관과 유사한 주사방식인데, 이 경우 전자 빔은 표면을 직선으로 훑어가고, 출발점으로 다시 돌아오고, 일정 크기만큼 아래로 이동한다. 이 과정으로 원하는 면적의 표면이 모두 주사될 때까지 반복한다. 이렇게 주사하는 동안 표면 위에서 신호를 얻게 되는데, 이 신호는 컴퓨터에 저장되어 나중에 영상으로 변환된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) DOCA를 activation 한다.

 

2) DOCA 160㎎과 촉매인 DCC(0.1g)와 HOSU(0.06g)를 유리용기에 넣고, solvent DMF 10㎖에 반응시킨다. 반응 중 수분을 억제하기 위해서 마개를 테프론을 이용하여 감싼다. 그리고 반응기(Rotamantle)에 넣고, 충분한 반응을 위해서 2～3시간 정도 반응시킨다.

 

3) PEI(2g) + DMF 10㎖을 유리용기에 넣고, 마개를 테프론으로 감싸 단단히 헐겁지 않게 하고, 반응기에서 충분히 녹을 때까지 반응시킨다.

 

4) 충분히 반응시킨 1번을 filter paper를 이용하여 filter하고 urea를 제거한다. urea가 걸러지면 filter paper가 반짝반짝하다.

 

5) 2)에 1)을 천천히 dropping 한 후 overnight한다.

 

6) 투석막(8000)에 4를 넣고, DMF를 제거하는 투석을 한다.

 

7) 투석막은 재활용이 가능하며 쓰기 전에 증류수로 깨끗이 세척하고 사용한다. 투석막에 나가는 DMF양보다 들어오는 증류수의 양이 많으면 압력을 견디지 못해서 터질 수 있다. 이것을 방지하기 위해 클립부분을 파라필름으로 단단히 감싸준다. 깨끗한 증류수가 들어가게 하기 위해서 2～3시간 마다 증류수를 갈아주어야 한다.

 

8) freeze drying. (lyophilization)

 

9) 양이 너무 많은 경우 ultra filtration을 이용하여 농축시킨 후 freeze drying

 

10) 표면적을 넓히기 위해서 돌리면서 건조시킨다

 

 

 

[생체재료공학실험]PEI-DOCA Conjugation 레포트