일반생물학실험 | 타액 조직 혈액 sample로부터의 DNA 추출

 

 

 

본 실험은 생명을 이루는 가장 핵심 물질인 DNA를 RFLP 방법을 이용해 ADH와 ALDH2의 유전자형 분석을 하고 각종 sequencing 방법을 이용해 polymorphism을 찾아내기 위한 과정의 첫 단계로 DNA를 3가지의 세포에서 분리, 추출해내는 실험이다. 분리, 추출해낼 세포는 타액의 상피세포와 소의 근육조직 세포, 그리고 혈액의 백혈구 세포이고 각 세포들은 pre-lysis, cell-lysis, isolating gDNA 과정을 거쳐 DNA를 분리, 추출해낸다.

 

상피세포의 경우 먼저 세포를 얻기 위해 1.5㎕ tube에 타액(침)을 넣어주고 타액 안의 상피세포를 NaCl buffer와 섞어준 뒤, 충분히 반응시키고 원심분리 시켜 상층액을 제거해 cell lysis를 시킬 준비를 마치고 형성된 pellet을 nuclei lysis buffer와 함께 voltexing시켜 pellet을 풀어주고 incubation과정을 통해 핵막을 제거하고 단백질과 DNA를 분리하기 위해 PPT buffer를 넣고 sample을 차갑게 하여 DNA 추출하기에 최적의 온도 상태를 만든 뒤, 원심분리 시키면 gDNA를 isolating하기 위한 준비는 끝나고 DNA가 담겨 있는 상층액을 pellet이 따라오지 않게 다른 튜브에 옮긴 뒤, DNA를 가라앉히기 위해 isopropanol을 넣어주고 원심분리를 통해 가라앉은 pellet을 EtOH로 처리해 탈수 시키고 완전 건조시켜 순수한 DN만 남도록 하고 DIW를 넣어 녹인 뒤, 전기영동 과정을 통해 DNA를 확인한다.

 

상피세포 뿐만 아니라 소의 근육세포와 혈액의 백혈구세포도 이와 마찬가지 3단계의 과정을 거치는데, 첫 번째, pre-lysis과정과 cell-lysis 과저에서만 약간의 차이가 있을 뿐, isolating과정과 전기영동 후 DNA 확인과정은 모두 동일하다. 근육세포의 경우 pre-lysis 단계에서 조직이 덩어리 져 있기 때문에 최대한 잘게 썰어 반응 표면적을 넓히고 cell-lysis에서 조직을 풀기위해 tissue lysis buffer와 protease를 첨가해준다. 그리고 백혈구세포의 경우는 핵이 없는(DNA가 없는) 적혈구를 제거하기 위해 RBC lysis buffer를 pre-lysis 단계에서 넣어주고 cell-lysis 단계에서 nuclei lysis buffer와 protease를 함께 넣어주는 차이만 있다.

 

실험결과, 8개의 타액샘플에서는 1개의 DNA band만 관찰할 수 있었고, 근육세포에서는 2개의 sample 모두에서 band를 확인하였고, 백혈구세포에서는 2개중 1개의 sample만 band가 나타났다. 타액의 경우 sample 채취가 각기 다른 피험자로부터 이루어졌지만 band의 유무가 너무 확연했기에 실험과정에서 타액과 NaCl buffer 비율 조절 실패에 의한 DNA 손상이나 상층액 제거과정에서 pellet이 딸려온 경우 등을 생각해 볼 수 있었고 혈액 세포도 마찬가지로 RBC lysis buffer의 농도 조절 실패로 RBC cell뿐 만 아니라 백혈구에 까지 lysis가 일어났을 가능성을 생각해 볼 수 있었다.

 

마지막으로 근육세포는 두 가지 sample모두에서 band가 나타났지만 band가 상대적으로 굵고 진한 것과 연한 것이 나타났다. 또한 다른 조직세포들에 비해 유독 작은 size band에서 많은 band들이 나타났다. 먼저 두 band간의 상대적 굵기와 진하기는 DNA의 추출 과정에서 좀 더 정교함과 연관될 수 있겠고, 작은 size band들은 근육세포에만 유독 많은 미토콘드리아가 가진 상대적으로 작은 크기의 DNA들에 의해 나타난 것으로 볼 수 있을 것이다.

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실험 방법

1. 실험 요약

본 실험을 시행하려면, DNA를 추출해야 하는데, 타액과 조직, 혈액을 통해 DNA를 얻기로 한다. DNA를 얻는 과정은 세가지 경로 모두 Pre-lysis, Cell-lysis, Isolating gDNA의 세가지 단계를 거친다. 세부과정 상에서는 실험절차가 조금씩 다르지만, 전체적인 과정에서의 목표는 같다.

 

Pre-lysis에서는 세포를 본격적으로 lysis하기 전의 준비과정으로 세포막을 깨뜨리거나 얻고자하는 대상의 표면적을 최대한 넓혀 lysis시키기에 최적의 상태를 만든다. Cell-lysis에서는 핵막을 깨뜨려 얻고자 하는 DNA와 단백질들을 구분해서 기타 단백질들을 제거하는 과정이고 Isolating gDNA에서 DNA를 얻어낸다.

 

첫째, 타액에서 DNA를 추출하기 위한 pre-lysis단계로 1.5㎖ tube에 자신의 타액을 600㎕정도 넣어주고 NaCl buffer도 900㎕정도 함께 넣어준다.

 

둘째, DNA를 추출할 경로는 소의 근육조직(tissue)이다. pre-lysis과정은 타액과 마찮가지로 1.5㎖ tube를 준비하고 쌀 한톨 크기로 자른 소의 근육조직을 tube로 옮기고 tube내에서 해부용 가위를 이용해 최대한 잘게 썰어준다.

 

셋째, DNA를 추출할 혈액(사람) 또한 마찬가지로 1.5㎖ tube에 혈액을 300㎕ 넣어준 뒤(혈액 채취 시 혈액의 점성으로 인해 일반 tip을 쓸 경우 구멍이 막힐 수 있으므로 끝이 넓게 잘린 cutting tip을 사용한다), RBC lysis buffer를 약 1㎖ 정도 넣어주고 voltexing 시켜준다.

 

 

 

[일반생물학실험]타액 조직 혈액 sample로부터의 DNA 추출 레포트