식품중의 단백질은 탄소, 수소, 산소의 각 원소 외에 반드시 일정량의 비율로 질소를 함유하고 있다. 특히 질소는 지방이나 탄수화물 등 식품의 다른 중요 성분에는 포함되어 있지 않으므로, 식품중의 단백질 정량은 전질소량을 정량하고 그 값에 일정의 계수를 곱하여 조단백질의 양을 구한다.
가장 널리 사용되어지는 정량법의 한 가지로서 감도도 좋고, column chromatography에 있어서 단백질의 정량에 적합하다. 또한 이하에 나타낸 물질이 혼재하여도 정량치에 영향을 주지 않는다. 본 법의 원리는 알칼리성에서 단백질의 펩타이드 결합과 구리가 반응해 구리 이온을 생성하는 뷰렛 반응 원리를 이용한 실험이다. 구리 이온은 방향족 아미노산의 산화를 유도하여 인몰리브덴산(인덩스덴산)이 단백질 중의 트립토판과 티록신에 의해 환원되어 인몰리브덴블루(인덩스덴블루)의 청색을 나타내는 것에 기초를 두고 있다
Lowry 분석법
Lowry method는 널리 쓰이는 방법으로 알칼리 조건에서 구리 ion이 peptide bond에 결합하는 biuret method에 기초를 두고 있다. 생성된 구리가 inorganic salt mixture인 Folin reagent와 Folin-Ciocalteu반응을 하는데 phosphomolybdotungstate가 구리에 의한 aromatic amino acid의 산화에 의해 heteropolybdenum blue로 환원되는 반응에 의해 진환 푸른색을 발색한다.
장점 : 0.01㎎/㎖정도의 양까지 감지할 수 있을 정도로 민감하고 단백질이 침전되어 있더라도 측정할 수 있고 측정범위는 0.01-1.0㎎/㎖이다.
단점 : Biuret method에 기초를 두고 있기 때문에 단백질의 종류에 따라 그 값이 변할 수 있고 Folin-Ciocalteu반응을 방해하는 물질들이 많기 때문에 단백질 용액에 그러한 물질이 있는 경우, 제거를 하거나 보정을 해주어야 한다.
실험 방법
1. 용액 준비
① A (100㎖) CuSO4·5H2O0.5g + 1g Sodium citrate, 100㎖ 증류수
② B (1L) 20g Sodium Carbonate + 4g Sodium Hydroxide, 1L 증류수
③ C (51㎖) 1㎖ Solution A, 50㎖ Solution B
④ D (20㎖) 10㎖ Folin-Ciocalteu phenol reagent, 10㎖ 증류수
2. 실험 진행
① Sample solution을 0.5㎖ 증류수와 준비한다.
② Solution C 2.5㎖를 넣는다.
③ Vortexing 하고 상온에서 5～10분간 둔다.
④ Solution D를 0.25㎖ 넣고 vortexing 한다.
⑤ 20～30분 뒤에 750 nm에서 O.D
y=ax+b 꼴의 그래프가 그려지는데 y=abs(흡광도), x=농도(㎎/㎖)이다.
단백질함량(㎎/㎖)=(Sample Abs-b)x희석배수
[생명공학실험]Lowry 법을 이용한 단백질 정량 레포트
1. 실험 이론 및 원리 가. 실험 소개 식품중의 단백질은 탄소, 수소, 산소의 각 원소 외에 반드시 일정량의 비율로 질소를 함유하고 있다. 특히 질소는 지방이나 탄수화물 등 식품의 다른 중요 성분에는 포함되어 있지 않으므로, 식품중의 단백질 정량은 전질소량을 정량하고 그 값에 일정의 계수를 곱하여 조단백질의 양을 구한다. 나. 실험 배경 가장 널리 사용되어지는 정량법의 한 가지로서 감도도 좋고, column chromatography에 있어서 단백질의
www.happycampus.com
댓글