생화학실험 | BCA 분석법

 

 

 

BCA분석법은 비색정량법의 일종으로 시료액 중의 아미노산과 시약의 반응에 의한 발색을 비색하여 목적으로 하는 화합물을 정량 하는 분석법으로 20가지 종류의 아미노산 중에 대표라고 할 수 있는 Cysteine(시스테인) 을 사용합니다. BCA분석법에서 사용되는 녹색의 발색시약은 시료액 속에 아미노산이 포함되어있을 경우 보라색으로 변색하며 시료액 속에 아미노산의 농도가 높을수록 더욱 진한 보라색이 됩니다.

 

 

 

BCA(Bicinchoninicacid)

① BCA assay는 Bicinchoninicacid에서 나온 말이고, Pierce방식이라고도 한다.

 

② 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛화합물이 생성 → 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수. 즉 흡수율이 증가→그것에 비례해서 Sample에 있는 단백질 양을 결정

 

③ 단백질 농도에 따른 흡수율에 대한 데이터가 있어야 그 결과가 의미를 가진다. 즉, 어떠한 농도에선 흡수율이 어느 정도이고,다른 농도에선 흡수율이 어느 정도 라는 것이 측정되어 표준이 정해져 있다면, 흡수율만 알면 농도를 구할 수 있는 것이고, 농도를 알면 그 Sample의 단백질 양을 알 수 있다.

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실험 방법

1. 표준 Cysteine 용액들을 농도 별로 제조

1) 실험테이블 당 대표 1개조가 0.02 M 농도의 Cysteine 용액을 50㎖ 메스플라스크에서 만든다.

 

2) 각 실습조별로 위 1)의 0.02M Cysteine 용액 0.1㎖을 증류수 0.9㎖ 과 혼합하여, 최종적으로 0.002M (2mM) 농도의 Cysteine 원액을 제조한다.

 

 

3) 위 2)의 2mM Cysteine 원액을 이용하여, 아래 표에 따라 각 농도의 표준 Cysteine 용액들을 3개 만들고 잘 혼합한다.

각 표준 용액의 번호	(1)	(2)	(3)
각 표준 용액의 Cysteine 농도 (mM)	0.25	0.5	1.0
2 mM Cysteine 원액의 첨가량 (㎕)	100	200	400
증류수의 첨가량 (㎕)	700	600	400
총량 (㎕)	800	800	800

 

2. 발색 시약의 제조

1) BCA 분석키트에 포함된 Reagent A 와 Reagent B를 각각 12.5 ㎖ 과 250 ㎕ 만큼 혼합하여 발색 시약을 제조한다. 천천히 혼합한다.(50:1)

 

3. 분광광도계

1) 위 용액들을 37℃ 히팅블럭 이나 수조에서 30분 간 처리한다.

 

 

2) 발색된 용액의 용기들을 흐르는 수돗물로 식히고, 물기는 티슈로 닦는다.

 

3) 분광광도계 562㎚에서, 증류수를 발색시킨 용액으로 영점을 잡고, 나머지 발색된 용액들의 흡광도를 측정한다.

 

4) 실험 결과를 지도교수에게 검사 받는다.

 

5) 발색 및 흡광도 측정

① 지도교수로부터 Semi-Micro 큐벳 1개와 미지의 시료액 0.2㎖를 받는다.

② 증류수(바탕액, Blank액), 위 단계에서 제조한 표준 Cysteine 용액들3개, 그리고 미지의 시료액, 이들 각 100㎕ 에 발색시약 2㎖을 각각 첨가하여 혼합한다.

③ 혼합된 용액들은 살살 흔들어서 잘 섞어준다.

 

4. 마이크로플레이트 리더

1) 표준 Cysteine 용액들을 농도 별로 제조(공통)

 

2) 발색 시약의 제조

 

3) BCA 분석키트에 포함된 Reagent A 와 Reagent B를 각각 2㎖ 과 40 ㎕ 만큼 혼합하여 발색 시약을 제조한다. 천천히 혼합한다.

 

4) 발색 및 흡광도 측정

① 지도교수로부터 마이크로플레이트 1개와 미지의 시료액 0.2㎖를 받는다.

② 증류수(바탕액, Blank액), 위 ‘#1’ 단계에서 제조한 표준 Cysteine 용액들3개, 그리고 미지의 시료액 이들 각 25㎕ 를 마이크로플레이트의 적당한 well 들에 첨가한다..

③ 각 well 들에 발색시약 200㎕ 씩을 첨가한다. 첨가할 때마다, ‘피펫팅’으로 섞어주고, 팁은 새로이 바꿔준다.

④ 마이크로플레이트를 37℃ 의 배양기에서 30분간 처리한다.

⑤ 30분 후 즉시, 마이크로플레이트 리더의 562㎚에서 각 well 들의 흡광도를 측정한다.

 

 

 

[생화학실험]BCA 분석법 레포트