일반생물학실험 | 효소활성에 온도, pH가 미치는 영향

 

 

 

TIP

 

 

전분 분해효소인 아밀라아제(amylase)의 효소 촉매활성에 미치는 요인들 중 반응 중의 온도와 pH가 효소활성에 미치는 효과를 관찰한다.

 

 

 

세포의 물질대사과정에는 복잡한 분자를 간단한 분자로 분해하는 이화작용과 작은 분자들로부터 세포 내 고분자들을 합성하는 동화작용이 있다. 이때 반응에 참여하는 반응물질을 기질이라고 부른다. 기질과 효소의 상보적인 구조적 특성으로 인하여 각 효소들은 기질에 대한 높은 특이성을 획득하게 된다.

 

효소는 활성부위에서 생성물을 쉽게 만들 수 있도록 효소와 기질의 복합체를 전이상태로 전환시킴으로써 반응의 활성화 에너지를 감소시킨다. 효소반응은 기질 간의 충돌속도에 의해 반응속도가 결정된다. 반응온도가 상승하면 기질의 운동에너지가 증가하여 반응속도가 증가하게 된다. 반면 지나친 온도의 증가는 효소 활성부위의 구조가 파괴되는 효과를 가져온다.

 

효소 분자들이 너무 많은 에너지를 흡수하게 되면 약한 비공유 결합들이 깨어짐과 동시에 3차원적 구조가 파괴되어 효소활성을 상실하게 된다. 또한 효소 주위의 수소이온 농도도 효소 분자의 3차원적 구조를 유지시키는데 관여한다. 따라서 모든 효소들은 반응속도를 최대로 유지하는데 필요한 최적온도와 최적산성도를 갖게 된다.

 

전분의 가수분해 효소인 아밀라아제의 활성은 반응결과 생성된 포도당 등 환원당의 생성여부를 환원당 측정법에 의하여 측정함으로써 알 수 있다. 환원당과 구리 시약의 반응으로 생성된 산화제일구리를 산성조건에서 인몰리브덴산과 반응시켜서 몰리브덴청으로 발색되는 정도를 측정한다.

 

 

효소의 반응에 영향을 미치는 요소

1. 기질의 농도 : 저해제

① 기질

 

효소의 기질 특이성 : 효소의 활성부위(active site)에 결합하여 반응을 일으킨다.

 

② 농도로 인한 유효충돌수의 증가로 인해 기질의 농도에 비례해 반응속도가 증가한다.

③ 일정기간 반응속도가 증가 하지만 효소의 수가 제한되어 있기 때문에 일정해진다.

 

 

2. pH

① 효소마다 최적 pH가 다르다.

② 최적 PH외의 범위외의 pH 변화가 일어나면 효소의 구조가 변성이 일어나서 기질과 결합을 못하게 된다.

 

펩신은 위에서 활동, 아밀레이스는 입에서 활동, 카탈레이스는 간에서 활동, 트립신은 소장에서 활동

 

3. 온도

① 온도가 증가 하면 효소와 기질간의 유효충돌 개수가 증가하여 반응속도가 높아진 다. 그러나 효소가 37℃가 넘어가면 단백질에 변성이 일어나 반응속도는 다시 줄어든다.

 

적정 온도는 체온과 비슷한 35~40℃ 이다. 보통 체온 범위인 35~40℃ 정도가 적정온도 이며, 이 온도까지는 효소와 기질의 운동이 활발해져서 효소, 기질복합체의 형석속도가 빨라진다. 그렇지만 최적 온도를 넘어서면 효소의 주성분인 단백질의 입체 구조가 변하여 효소의 활성이 떨어져 반응속도가 감소하거나 아예 일어나지 않게 된다.

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실험 방법

1. 전분의 가수분해

1) pH 별 전분의 가수분해

① 15㎖ tube의 몸통과 뚜껑에 “Buffer 1 +전분”, “Buffer2+전분”, “Buffer3+전분”으로 표기한다.

② 표기한 3개의 15㎖ tube에 전분을 넣은 (50㎎/2㎖) buffer1(pH 7.3), buffer2(pH 2.7), buffer3(pH 10.0)

③ 여기에 각각의 동일한 pH buffer에 녹인 3%amylase 용액 1㎖을 첨가한다.

④ 10초간 vortexing을 한 후 37℃ 항온수조에서 15분간 반응한다. 이 때 반응이 잘 진행되도록 5분 간격으로 10초가 vortexing을 한다.

 

2) 온도별 전분의 가수분해

① 15㎖ tube의 몸통과 뚜껑에 4℃, 37℃, 100℃로 표기한다.

② 표기한 3개의 15㎖ tube에 전불을 넣은 (50㎎/2㎖) buffer1을 10번 invert mix 한 후 2㎖씩 넣는다.

③ buffer 1에 녹인 3% amylase 용액을 1㎖ 첨가한다.

④ 10초간 vortexing을 한 후 아이스가 담긴 비커(4℃), 37℃와 100℃로 세팅된 water bath에서 15분간 반응한다. 이때 반응이 잘 진행되도록 5분 간격으로 10초간 vortexing을 한다.

 

2. 환원당의 측정

1) 9개의 15㎖ tube를 준비햐여 6개의 tube의 몸통과 뚜껑에는 세 pH와 세 온도를 표기하고 나머지 3개에는 0.1% glucose, 무처리 전분, blank로 표기한다.

 

2) 각 15㎖ tube에 증류슈 450㎕씩 분주해 둔다.

 

3) 반응이 끝난 6개의 tube에서 50㎕씩 취해 증류수를 분주해 둔 각 tube에 넣는다.

 

4) 남은 3개의 tube에는 대조구로 0.1% glucose 용액, 무처리 전분, 증류수를 각각 50㎕씩 넣는다.

 

5) 9개의 tube에 적정용액 D(적정용액 A 25㎖ + 적정용액 B 1㎖)를 1㎖씩 넣고 10초간 vortexing 한다.

 

6) 100℃로 맞춘 항온수조에서 15분간 끓인다.

 

7) 실온에서 5분 정도 식힌 후 적정용액 C를 500㎕씩 넣고 10초간 vortexing 한 뒤 실온에서 15분간 반응시킨다.

 

8) 9개의 tube에 증류수 5㎖씩 넣어 희석한 후 (invert mix 10번) 각 tube에서 1㎖씩 취해 Y cuvette에 넣는다.

 

9) UV/VIS spectrophotometerfh 520mm를 설정하고 증류수만 넣은 시료를 blank로 설정한 뒤 나머지 8개의 시료를 측정한다. (Y cuvette의 화살표 방향을 기준으로 광원이 통과되게끔 유의하여 측정한다.)

 

 

 

[일반생물학실험]온도와 pH가 효소작용에 미치는 영향

 

 

 

[일반생물학실험]효소활성에 온도, pH가 미치는 영향 레포트