일반생물학실험 | Macromolecules - Proteins Carbohydrates Lipids

 

 

 

TIP

 

 

1. 세포를 이루고 있는 생체 거대분자의 존재를 생화학적인 실험 방법을 통해서 확인하고 이들의 양을 정량 하는 기술을 습득한다.
2. 표준 단백질용액(standard protein solution)을 이용하여 단백질 농도 검량선을 작성하고 미지 시료의 단백질 농도를 측정한다.

 

 

 

세포를 이루는 분자는 단순한 구조와 기능을 가지고 있는 유기분자들이 모여서 거대분자 (macromolecule)를 형성한다. 세포 내 거대분자는 크게 4 종류로 나눌 수 있다: 단백질 (proteins), 탄수화물 (carbohydrates), 지질 (lipids), 핵산 (nucleic acid). 단백질은 원형질과 효소의 구성요소이며, 탄수화물은 에너지원으로 중요한 역할을 한다. 지질은 모든 생체막 (biomembrane)의 주요 성분이며 에너지원이다. 이러한 거대분자에 대한 생화학적인 확인과 구조에 대한 이해는 세포내 분자들의 기능 및 작용 기전을 분자 수준에서 이해하는데 필수적이다.

 

 

단백질 정량

시료 내에 포함된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정이다. 이때 단백질을 정량하기 위하여 사용되는 여러 가지 방법들에 대하여 알아보자.

1. UV spectrophotometry

 

 

방향족 아미노산인 Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophan은 280㎚의 자외선을 흡수한다. 또한 이때의 흡광도는 단백질의 농도에 비례한다. UV spectrophotometry은 Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophan의 280㎚에서의 최대흡광을 이용하는 방법이다. 이 방법은 50㎍ - 1 ㎎ 범위의 단백질양의 측정이 가능하다. 또한 원하는 값을 단백질의 변형 없이 빠르게 알 수 있다는 장점이 있다. 그러나 Buffer, pH, Salt, Purines, Pyrimidines, Nucleic acids 등에 영향을 받으며 아미노산 조성에 따라 값이 달라져 구한 결과값의 정확도가 떨어지는 단점이 있다.

 

2. Biuret assay

Biuret assay는 알칼리 조건하에서 Cu²⁺ 이온이 단백질의 peptide nitrogen에 결합하여, 보라색의 착 화합물을 생성하고, 540-560 ㎚에서 흡광을 나타내는 것을 이용한 방법이다. 이때 반응의 결과로 생성되는 착 화합물의 양은 단백질의 농도에 의하여 정해진다. 또한 이 방법의 경우 아미노산의 조성에 따른 차이가 없다. 그러나 반응의 민감도가 낮기 때문에 이 방법 또한 결과값의 정확도가 떨어진다.

 

3. BCA assay

BCA assay은 단백질 용액에 Cu²⁺이온을 반응시킨 후, Bicinchoninate(BCA)가 Tryptophan, Tyrosine, Cysteine의 도움으로 Cu⁺ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법이다. 이때 562 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 알아낼 수 있다. BCA assay은 다른 방법에 비하여 SDS, Triton등의 변수에 의한 영향이 적다. 그러나 아미노산 조성에 따라 값이 달라져 결과값의 정확도가 떨어지는 단점이 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

∴ Bradford assay 방법은 ribonuclease나 lysozyme 같은 적은 분자량의 염기성 polypeptide를 제외한 대부분의 단백질의 정확한 정량에 사용된다. 하지만 이 방법은 시료안에 0.2% 이상의 detergent(에를 들면, Triton X-100, SDS, NP-40 등)가 존재할 경우 결과가 정확하지 못한 단점이 있다.

 

1) 단백질의 양을 모르는 시료(milk)를 다음의 비율로 증류수를 이용하여 마지막 부피가 10㎖이 되게 희석한다. 0, 1/5000, 1/2500, 1/1000, 1/500, 1/100

 

2) 각각의 희석된 시료로 부터 200ul씩 2개의 label된 시험관에 분주한다.

 

3) 단백질의 양을 알고 있는 standard solution(1㎎/㎖ BSA, bovine serum albumin)을 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100㎕씩 각각 2test tube에 분주한다.

 

4) 2)의 시료에 증류수를 첨가하여 마지막 부피가 200㎕이 되게 한다.

 

5) 각각의 standard tube와 시트(희석된 우유)에 5㎖의 protein reagent를 넣고 거품이 생기지 않도록 parafilm으로 시험관을 봉한 뒤 천천히 뒤집으면서 섞어준다. 발색이 되도록 약 5분 정도 기다린다.(단, 30분을 넣지 않는다.)

 

6) 595㎚의 파장에서 먼저 standard solution의 흡광도를 측정하여 기록하고, 시료의 흡광도를 측정, 기록한다.

 

 

 

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