1. 미생물 실험의 기초가 되는 멸균과 소독의 개념을 이해하고 배양배지를 만들어 식품위생검사를 위한 균의 접종 및 배양방법을 익히도록 한다.
2. 미생물을 그람 염색하여 염색된 세균의 표본을 관찰한 후 동정된 균의 형태적, 생리적 특성을 파악한다.
미생물
육안의 가시한계를 넘어선 0.1㎜ 이하의 크기인 미세한 생물로 주로 단일세포 또는 균사로써 몸을 이루며, 생물로서 최소 생활단위를 영위한다. 조류(algae), 균류(bacteria), 원생동물류(protozoa), 사상균류(mold), 효모류(yeast)와 한계적 생물이라고 할 수 있는 바이러스(virus) 등이 이에 속한다.
배지의 정의 및 분류
1. 배지
실험실에서 식물 및 동물세포, 미생물의 배양에 필요한 각종 영양분을 섞어 인위적으로 만든 혼합물, 균종이나 세포 종에 따라서 필요로 하는 영양성분이 다르므로 각각의 균종에 따라 적절한 배지를 만들어야한다. 또 배지는 액체, 반고체, 고체상으로 만들 수 있다. 액체배지에 홍색 해조류에서 얻은 한천(agar, 복합탄수화물류임)이나 젤라틴(gelatin)을 첨가하여 반고체 또는 고체배지를 만든다.
2. 사용 목적에 따른 분류
① 증식용 배지 : 다수의 영양성분이 충분히 함유된 배지로서 대다수의 균종이 잘 자라는 배지다.
② 선별증균배지 : 수종의 세균이 혼재되어 있는 가운데서, 다른 균에 비해 한 특정 균의 빠른 증식을 도모하고자 할 때 배지 속에 촉진제나 억제물을 포함시켜 만든 특수 배지다.
③ 감별배지 : 세균의 혼합 집단에서 어느 한 종의 균을 골라내기 위해 사용하는 배지. 균이 지닌 특징적 효소반응을 이용하거나, 때로는 다른 균의 증식을 억제하는 증식 저지물질을 첨가하여 목표하는 균을 선택적으로 골라내는 데 쓰는 배지다.
3. 사용형태에 따른 분류
① 고체배지 : 액체배지에 agar, 젤라틴, 실리카겔 등을 첨가하여 굳힌 것으로 고체배지는 미생물의 보존 배양, 순수 분리 등에 사용된다. 고체배지는 평판배지, 고층배지, 사면배지 등이 있으며 목적에 따라 사용 방법이 다르다.
| 평판배지(Plate medium) 사면배지(Slant medium) |
반사면배지(Semislant medium) 고층배지(Butt medium) |
② 액체배지 : 각 성분을 증류수에 녹인 액상의 배지로 broth 또는 bulion이라 하며 미생물의 증식, 생화학적 검사 및 대사산물 검출 목적 등에 사용된다.
실험 방법
1. 고체평판 배지의 준비
1) 500㎖ 메디아 병에 메스실린더를 이용해 증류수 50㎖을 붓는다.
2) 유산지를 저울 위에 올려놓고 LB media mixture(peptone 10g, yeast extract 5g, Nacl 10g) 2.5g을 달아서 메디아병 안에 넣는다(증류수로 잘 씻은 약수저를 휴지로 닦아 물기를 완전히 제거한 후 시약을 계량한다. 한 시약 계량 후에는 약수저를 세척하도록 하며, 부주의하여 시약통의 시약이 다른 시약에 의해 오염되지 않도록 한다).
3) Agar 1.5g을 재서 메디아 병에 넣는다(시약을 메디아 병에 넣을 때는 병 입구에 시약이 묻지 않도록 주의해서 넣는다).
4) 메스실린더를 이용해서 증류수 50㎖을 메디아 병에 가하여 최종 부피가 100㎖이 되도록 하고, 메디아 병을 잘 흔들어 Agar를 완전히 녹인다.
5) 메디아 병뚜껑을 반쯤 열어 전자레인지에 약 1분 40초 동안 가열한다(배지가 맑아질 때까지 가열하고 배지가 넘치지 않도록 주의한다).
6) 실험 테이블 위를 70% 알코올로 깨끗이 닦고 알코올램프를 켜둔다.
7) 가열한 배지를 전자레인지에서 꺼낸 후 메디아 병을 살살 흔들어 배지를 잘 혼합하고, 45～50℃ 가량 까지 식힌 후(8～10분 소요) 페트리접시 뚜껑을 열어 배지를 고르게 분주하고 재빨리 뚜껑을 닫는다.
2. streaking 연습
3. 균체의 접종
1) 배지가 완전히 굳으면(약 30분 소요) 백금이를 환원염(녹색)에서 산화염(주황색)방향으로 움직이면서 백금선 전체의 약 1/3정도까지 천천히 통과하며 화염멸균하고 백금이가 붉은색을 띄면 공기 중에서 식힌 후 배지표면 가장자리에 접촉시켜 완전히 식힌다.
2) 식힌 백금이로 생수를 한 두 차례 떠서 평판배지에 도말(streaking)한다.
3) Escherichia coli와 Bacillus megaterium의 액체배양액을 각각 다른 멸균된 백금이로 떠서 다른 평판 배지에 도말한다.
4) 사용한 백금이는 불꽃으로 살균한 후 제자리에 둔다.
5) 접종한 페트리접시는 뒤집어서 배지로 페트리접시 뚜껑에 맺힌 물이 떨어지지 않게 하고, 페트리접시 가장자리에 접종한 시료, 날짜, 학과, 조를 기입한다(글씨를 크게 쓰면 배양 후 콜로니 관찰이 어려우므로 최대한 작게 기입).
6) 페트리접시는 뒤집어서 37℃ incubator에서 1-2일 정도 배양한 후 꺼내서 냉장 보관한다.
4. 박테리아의 관찰(그람염색)
1) 전 주에 배양한 배지를 준비한다.
2) 이쑤시개를 이용하여 고체배지에 있는 균을 떠낸다.
3) 이쑤시개로 떠낸 균을 슬라이드 글라스 위에 가능한 얇게 편다.
4) 도말된 표본을 공기 중에 30초간 건조시킨다.
5) 말린 도말 표본을 불꽃사이로 두 번에서 세 번 통과시켜 균을 슬라이드에 고정시킨다.
6) 고정된 도말표본이 식은 후, crystal violet용액을 1방울 가하고 1분간 방치한 뒤 여분의 염색액을 버리고 슬라이드 글라스를 물로 씻어낸다.
7) Gram’s iodine 용액을 도말 부위에 1방울 떨어뜨리고 1분 뒤에 물로 씻어낸다.
8) 95% ethyl alcohol 1방울로 30초간 대조 염색한 후 물로 씻어낸다.
9) safranin solution 1방울로 30초 동안 탈색 후 물로 씻어낸다.
10) Filter paper로 물기를 제거한 후 실온에서 말리고 커버글라스를 덮는다.
11) 1부터 반복하여 다음 표본을 준비한다.
12) 400배에서 광학현미경으로 검경하여 그람양성, 음성균 및 간균, 나선균, 구균을 판별한다.
5. 영구프레파라트 관찰
1) 영구프레파라트를 광학현미경에 고정하고 조별로 이동하면서 저배율에서 고배율로 관찰한다. (영구프레파라트와 광학현미경은 이동시키지 않는다.)
1) 관찰한 결과를 스케치 한다.
A: Three types of bacteria, B: 유산균, 녹병균, 초산균
[일반생물학실험]미생물 배양 및 세균검사 박테리아의 동정 레포트
1. 실험 목적 가. 미생물 실험의 기초가 되는 멸균과 소독의 개념을 이해하고 배양배지를 만들어 식품위생검사를 위한 균의 접종 및 배양방법을 익히도록 한다. 나. 미생물을 그람 염색하여 염색
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