생화학실험 | PCR & DNA Gel Electrophoresis

 

 

 

TIP

 

 

1. PCR을 이용하여 DNA를 증폭한 후 Agarose gel electrophoresis를 통해 DNA를 분리한다. 
2. PCR의 원리를 이해하고 전기영동에 이용된 시약의 특성을 이해한다.

 

 

 

PCR

유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구 하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기하 급수적으로 증폭시킬 수 있다는 점이다. 이러한 PCR을 소개하기에 앞서서 간단히 분자 생물학적인 사항을 review해 보면 먼저 DNA의 구성을 살펴보면, DNA는 다음과 같이 phosphate group(인산기) - sugar(당) - base(염기)의 세 가지 요소로 구성되는 nucleotide라는 모듈이 쌍으로 연결된 것으로 이것이 이중나선 모양으로 위 아래로 연결된 모양을 하고 있다.

 

염기의 종류는 A(adenine), G(guanine)으로 구성된 purine group과 T(thymine), C(cytosine), U(uracil)로 구성된 pyrimidine group으로 나뉜다 DNA에서는 T로, RNA에서는 U로 존재한다. 또한 당의 2번 위치에 있는 OH group을 갖고 있진 않은 것이 DNA이며, 갖고 있으면 RNA가 되는데 이것으로 인하여 DNA와 RNA사이에는 많은 성질의 차이가 발생 합니다.

 

Phosphate group이 있는 쪽이 5‘(prime) 방향, sugar가 있는 쪽이 3’방향인데, 쌍으로 연결되는 염기는 그림과 같이 서로 반대방향(anti-parallel)으로 위치하는 것 이 특징이다. 즉, DNA 사슬은 서로 5‘과 3’방향이 반대이다. 이때 3‘방향에 노출되어 있는 3‘OH기를 연결 고리로 하여 DNA polymerase가 다음 nucleotide를 붙여주기 때문에 DNA의 합성은 반드시 5’에서 3‘방향으로만 진행 된다. 또한 DNA polymerase는 3’OH를 제공할수 있는 primer가 반드시 존재해야 한다.

 

PCR에서는 primer의 순도와 primer 내의 G(guanine)-C(cytosine) 염기 비율이 중요하다 Primer와 template가 완전히 결합해야만 원하는 DNA 산물을 얻을 수 있다. Primer가 template에 강하게 결합하기 위하여 G-C 염기의 비율이 A(adenine)-T(thymine) 염기의 비율보다 높은 조건을 만들어야 한다. 특히 primer가 template에 결합해서 DNA가 중합되는데 3' 말단의 결합이 중요하므로 primer 합성시 3' 말단에 G-C 염기가 3～4개 정도 위치하도록 하는 것이 바람직하다.

 

DNA polymerase의 성질을 이용하는 PCR은 DNA polymerase(Taq)가 단일가닥 DNA를 주형으로 해서 상보적인 DNA를 합성한다. 이러한 단일가닥 DNA는 두가닥 DNA를 끓임(denature)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 여기에 primer를 넣어주면 특정 DNA sequence의 양끝에 결합(anneal)하여 DNA polymerase가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 해준다.

 

 

또한 PCR(Polymerase chain reaction)은 시험관 내에서 반응혼합물을 연속적으로 고온반응(thermal cycling reaction)시켜 DNA를 증폭(amplication) 시키는 방법이다. 기질인 DNA를 고온에서 변성시켜 단일가닥의 주형 DNA로 만들어 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)와 상보적인(complementary) 결합을 시키고 DNA polymerase와 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)에 의하여 목적 DNA를 합성시키는 것으로 PCR을 설명할 수 있다.

 

일단 primer가 결합한 후에는 DNA polymerase의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extend)된다. 이렇게 ①denaturation ②annealing ③extension이 한 cycle이 된다. 다음 cycle에서 original DNA와 새로 합성된 DNA가 분리되어 단일가닥 DNA 주형이 된다. 따라서 n cycles후에는 이론적으로 2n의 두가닥 DNA가 존재하게 됩니다.

 

DNA를 변성 시키면 DNA polymerase도 같이 변성되므로 매 cycle마다 DNA polymerase를 넣어주어야 한다. 그러나, Thermus aquaticus라는 온천에 사는 세균이 발견되면서 이 문제는 해결되었다. 이 세균의 DNA polymerase(Taq polymerase)는 72℃가 최적온도이며, 94℃에서도 안정합니다. 따라서, Taq polymerase를 사용하면 매 cycle마다 DNA polymerase를 다시 넣지 않아도 된다.

 

 

전기영동(electrophresis)

전기장에서 분자가 매질을 통과하게 하여 물질을 분리하는 방법. 전하를 띠고 있는 물질이 전기장 내에서 움직이는 성질을 이용하여 그 물질을 분리, 분석하는 방법을 말한다. 생체 내의 고분자 중에는 핵산 및 단백질이 전하를 띠고 있는 대표적인 물질로서 전기영동을 이용하는 실험의 주요 대상이 된다.

 

DNA의 인산은 하나의 음전하를 띄고 있으며, 수천 개의 염기가 연결된 DNA절편은 그만큼의 음전하를 띤다. 따라서 전기장이 걸리면 DNA는 양극으로 끌리는데 그 이동속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류, DNA분자의 크기와 모양 등에 의해 결정된다.

 

 

실험 방법

1. PCR 실험

1) PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.(DNA와 primer를 섞는 과정)

① Microtube에

 

 

2) 혼합한 시료를 PCR 기계에 넣고 다음과 같은 프로그램으로 PCR을 시작한다.

 

 

3) 반응이 끝나면 10∼20㎕ 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응산물을 확인한다.

 

2. DNA Gel Electrophoresis 실험

1) DNA 전기영동기, gel 틀과 comb를 ethanol로 세척한다.

 

2) 1% Agarose Gel 만들기

① 1% LE Agarose용액 40㎖를 준비한다. → LE Agarose 0.6g + 1xTAE 60㎖(1x TAE 용액은 보통 50x TAE 용액을 제조하여 희석)

② 전자레인지에 데워서 녹인다.(1분 정도 끓게 되면 농도가 달라지므로 주의한다.)

③ EtBr용액을 50℃에서 3㎕을 넣는다.

④ Gel cast에 gel을 붓고 comb를 꽂음.

⑤ Agarose가 굳을 때까지 기다린다. (약 20분)

⑥ gel이 굳으면 comb을 제거하고 electrophoresis tank에 gel판을 옮긴다.

 

3) 전기영동 tank에 running buffer(1x TAE)를 gel을 1㎜정도 두께로 덮도록 채운다.

 

4) DNA sample을 loading buffer와 섞어준다.(sample DNA 6㎕ + loading buffer(Dye) 2㎕)

 

5) 홈(well)에 1kb DNA maker 1.5㎕ 와 loading buffer와 섞은 DNA sample을 넣는다.

 

6) 100V 전원을 연결한다. 전기장의 방향에 주의하여 전기영동 장치에서 젤의 먼 쪽이 양극(+)이 되게 한다.

 

7) 전기영동을 시작한다.(30분)

 

8) Gel을 꺼내어 세척용액(증류수)에 세척한다.

 

9) UV transilluminator로 확인한다.

 

10) 사진을 찍어 결과를 분석한다.(폴라로이드 카메라 또는 Imaging System(CCD카메라)

 

 

 

[생화학실험]PCR & DNA Gel Electrophoresis 레포트