일반생물학실험 | 단백질 분해 효소의 활성측정

 

 

 

TIP

 

 

연육작용의 원리를 알아보고, 이러한 작용을 하는 과일 속에 들어있는 단백질 분해 효소의 종류에 따른 효소활성도의 차이를 비교해 본다.

 

 

 

육류의 연화 (tenderization of meat) : 육류 중의 프로테아제의 작용에 의해 육질이 연해지는 것

육류의 표면에 있는 근형질막이 파괴되고 actomyosin을 가수 분해시켜 근원섬유로 나누어지게 함

 

연결조직의 섬유상 단백질에도 작용하여 collagen이나 elastin을 분해시킬 때 완전한 근육분해가 일어남

 

 

효소활성측정 : 효소의 측정, 즉 활성을 측정한다는 것은 효소의 유효량을 규명하는 것

효소반응은 일반적으로 반응시간이 경과함에 따라 반응속도가 경감하기 때문에 활성측정에는 초기속도를 사용

 

효소반응속도식인 Michaelis-Menten 식도 이러한 정상 상태에서의 효소를 취급

 

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 표준곡선(Standard curve)의 작성

① Tyrosine을 1000μ㏖이 되게 증류수에 녹여 Tyrosine 표준용액을 제조했다.

 

② Tyrosine 표준용액을 농도별로(1000μ㏖, 500μ㏖, 250μ㏖, 125μ㏖) 희석했다.

 

③ 희석한 용액을 각 0.5 ㎖ 씩 채취하여 시험관에 취했다.

 

④ 효소활성 측정 ⑦～⑩ 순서와 동일한 방법으로 Na₂CO₃와 Folin 시약을 가하고 발색시켜 흡광도를 측정했다.

 

2) 효소활성 측정

① 효소용액의 제조 : 과피와 씨가 제거된 과일 5g + 0.1M Tris-HCl buffer(pH 7.0) 10㎖ 혼합 → Mix → 3200rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 효소액으로 사용했다.

 

② 기질용액의 제조 : Casein을 2%의 농도로 제조하여 기질용액으로 사용했다.

 

③ 50㎖ tube에 기질용액 20 ㎖을 넣고 60℃ 항온수조에서 예열했다.

 

④ 기질용액에 효소(대조군, protease, 파인애플)용액 0.2 ㎖씩 첨가한 후 shaking 했다.

 

⑤ 각 시간별로(t=0, 10, 30, 50, 70, 90min) 1 ㎖씩 sampling후 TCA용액 2 ㎖이 들어있는 시험관에 첨가하여 침전이 생겨 가라앉을 때까지 방치했다.

 

⑥ 침전이 생기면 상등액 0.5 ㎖을 다른 시험관에 취했다.

 

⑦ 1M Na₂CO₃ 2.5 ㎖를 가했다.

 

⑧ Folin 시약 0.5 ㎖를 넣고 40℃에서 10분간 발색시켰다.

 

⑨ 660 ㎚에서 흡광도를 측정했다.

 

⑩ 표준곡선을 이용하여 시료용액의 Tyrosine의 양을 계산했다.

 

 

 

[일반생물학실험]단백질 분해 효소의 활성측정 레포트