일반생물학실험 | Gene Cloning

 

 

 

Gene cloning

생물체의 특정 유전자를 세포에서 추출한 후 그 유전자를 벡터 DNA에 삽입하고 Competent Cell에서 증식시킴으로써 균일한 유전자 집단을 생성하는 기술이다. DNA preparation, Insert DNA PCR, 제한효소 처리, Ligation, Transformation의 5가지 과정을 거쳐 진행된다. 먼저 원하는 유전자가 삽입될 플라스미드를 준비하기 위해 대장균을 배양한 후 Alkaline lysis를 이용해 균을 높은 pH에서 강한 음이온 세정제인 SDS로 처리하여 세포벽을 파쇄한다.

 

이때 염색체 DNA와 단백질, 깨진 세포벽 등은 SDS와 함께 침전되어 가라앉고 플라스미드 DNA는 용액 속에 유리되는데 이들을 원심분리하여 상층액으로부터 플라스미드 DNA를 분리 정제한다. 벡터에 삽입할 insert DNA를 제조하는데에 PCR 기술을 활용해 원하는 유전자의 서열을 증폭시킨다. insert DNA를 준비하는 과정에서 원하는 유전자는 기본적으로 단백질 발현을 위한 전체 염기서열이어야 하고 중간의 mutation이 없어야 한다. 또 운송체 역할을 하는 특정 vector에 삽입할 수 있는 결합부위를 생성시켜 주어야 한다.

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이후 특정 vector에 삽입할 결합부위를 생성시키기 위해 원하는 유전자에 제한효소처리를 한다. 제한효소는 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 phosphodiester 결합을 끊어서 DNA를 절단하는 능력을 갖고 있다. 제한효소에 의해 절단된 DNA 모양은 점착성 말단(sticky end) 또는 비점착성 말단(blunt end)이 만들어질 수 있다. 준비된 vector와 삽입할 insert DNA를 연결하며 이때 사용되는 효소를 DNA ligase라고 한다. 주로 T4 DNA ligase와 박테리아 유래 DNA ligase를 사용하는데 우리는 T4 DNA ligase를 사용하였다.

 

vector-insert 간 연결을 통해 재조합된 DNA는 competent cell에 도입하는데 이를 형질전환(transformation)이라고 한다. 일반적으로 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠는데, 세포막 역시 음전하를 띠므로 서로 전기적으로 반발한다. 그러므로 외부 DNA를 세포가 수용할 수 있도록 화학적 물리적 처리를 거쳐야 한다. 이러한 처리를 거쳐 형질전환에 최적화된 세포를 competent cell라고 한다.

 

위 과정을 거친 후 형질전환된 competent cell을 영양배지에서 대량으로 키운 후 스크리닝을 통해 insert DNA에 의한 재조합이 잘 이루어졌는지 확인하는 과정이 필요하다. 대표적인 방법으로는 blue-white screening이 있다. 재조합이 잘 이루어진 DNA는 제한효소의 절단부위가 벡터 의 MCS 내 LacZ 유전자를 잘라냈기 때문에 X-gal이 있는 배지에서 콜로니는 흰색으로 보인다.

 

 

 

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