분자생물학실험 | Cell Migration assay

 

 

 

TIP

 

 

Cell migration을 유도하고 chemotaxis의 원리를 이해한다.

 

 

 

Chemokines

케모카인은 약 100여개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질들의 집단으로, 선택적으로 백혈구 소집단의 세포접합, 화학유인작용, 활성화 등을 조절하는 cytokine을 말한다. 케모카인의 이러한 기능 때문에 이들이 염증반응에서 중추적인 역할을 하는 것이다. 케모카인은 림프조직 분아니라 비림프조직에서도 만들어져, 백혈구들이 림프조직이나 일반조직에서 이동하는 과정을 조절한다. 또한 케모카인은 혈관을 통과하여 조직으로 침투한 백혈구를 농도의 차이를 이용하여 염증부위로 유인하는 작용 (chemotaxix)도 나타낸다.

 

케모카인은 연속된 두개의 cystein의 위치에 따라 CC chemokine과 CXC chemokine의 두 가지 종류로 구분된다. 케모카인의 작용은 세포막의 케모카인 수용체에 의하여 나타나는데, 케모카인 수용체는 단백질 사슬이 세포막을 여러번 들락날락하는 모양을 하고 있기 때문에 serpentine receptor (뱀모양 수용체)라고도 부른다.

 

이 수용체가 자신과 반응하는 케모카인과 결합하면, 연결된 GTP binding protein이 활성화되고, 이어서 cAMP, IP3 등을 통하여 활성화 신호를 전달하게 된다. 케모카인에 의하여 활성화가 일어나면 세포는 모양이 변하기도 하고, integrin의 발현이 증가되며, 세균등을 죽일 수 있는 활성산소가 만들어진다. 또한, 대식세포와 호중구에서는 단백질분해효소와 세포내과립의 방출이 나타나며, 호염구에서는 histamin이 방출되고, 호산구에서는 세포독성단백질이 분비된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) transwell의 bottom well에 BSA를 600λ를 넣는다. 오른쪽 bottom well에는 chemokine이 들어있는 BSA를 600λ를 넣는다.

 

2) upper well을 각각의 bottom well위에 올려준다.

 

3) upper well의 평평한 부분에 100ng/㎖의 JK(JurKat)cell을 1×10⁶/100λ씩 넣어준다.

 

4) transwell을 cell culture incubator(37℃)에 1시간 30분 동안 넣어둔다.

 

5) incubetor에서 꺼낸 transwell의 upper well을 제거하고 bottom well를 resuspend 해준다.

 

6) 각 bottom well의 600λ중에서 pipette으로 12λ를 취해서 12λ의 trypham blue dye와 섞어준다. (1/2 delusion 됨)

 

7) Hemocytometer에 섞어준 용액을 pipette으로 12λ씩 취하여 위아래 한쪽씩에 넣어준다.

 

8) 현미경으로 Hemocytometer를 보면서 손으로 cell을 counting 한다.

 

 

 

Cell Migration assay 레포트