일반생물학실험 | Transformation - 미생물에서 재조합 단백질 발현

 

 

 

TIP

 

 

E.coli의 transformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다.

 

 

 

형질전환(TRANSFORMATION)

형질전환이란 수용세포에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정을 나타내며 몇몇의 박테리아 사이에서 자연적으로 일어나는 현상이다 (예로 Stretococcus와 Bacillus). 대장균을 포함한 다른 종은 외부DNA를 흡수할 능력이 없다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다. 움직이게 할 수 있는 DNA의 2번째 방법인 형질전환은 1928년 Fred Griffith에 의해 발견되었다.

 

형질전환은 유전자 형태에서 수용성 Chromosome의 분자 중간물과 합성된 물질인 드러난 DNA분자나 단편에서 이루어진다. 자연적인 DNA형질전환은 박테리아를 줌으로써 온다. 이 과정은 무한적이며 유전자의 어떤 부분도 박테리아 사이에서 형질전환 될 것이다. 박테리아가 섞이면 그들은 주위환경의 대부분의 DNA를 풀어놓는다. 이 단편들은 아마도 비교적 크고 여러 유전자를 내포하고 있다. 만약 이 단편이 반응성이 있는 세포와 접촉하면 DNA를 끌어들여 형질전환을 할 수도 있다.

 

비교적 DNA의 고농축은 정상적으로 자연 속에 제공되는 보다 높은 형질전환의 횟수 증가로 이용된다. 직선의 DNA조각들은 형질전환으로 사용할 때 E. coli는 대개 형질전환 하는 조각을 보호하기 위해 exonuclease활성을 만든다. 플라스미드는 직선 조각으로 쉽게 퇴화할 수 없기 때문에 숙주 안에서 복제될 수 있으며 플라스미드 DNA에서 박테리아로 형질전환하기 훨씬 쉬워진다. 이것은 박테리아 세포로 DNA을 재조합 하는 일반적인 방법이다. 어떤 원천으로부터 DNA는 형질전환하기 전에 플라스미드 DNA가 재접합 함으로써 안으로 끼워 넣을 수 있다.

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실험 방법

1. Transformation

1) 미리 준비해 둔 competent cell(BL21,DH5a)을 10㎕씩 각각의 Eppendorf tube에 분주한다

 

2) 여기에 다음의 DNA(NF-L) 0.2ng/1㎕씩 각각 넣어주고 gently mix

 

3) 얼음에서 30분동안 보관한다.

 

4) tube를 42˚C water bath로 옮겨 정확히 30초(do not shake)

 

5) 얼음에서 2분동안 chilling 시킨다.

 

6) tube에 SOC media를 첨가하고 room temperature(37˚C)에서 60분 동안 shaking incubati on(SOC의 양 BL21-40㎕) → eppendolf tube 이용

 

7) tube에서 50㎕를 취해 LB+Kan plate에 spreading한다.(spreading 전에 tube를 gently mix)

 

8) Incubation 37˚C 12시간 overnight

 

9) 하나의 colony를 10㎕ tip으로 집는다(살짝 건드리는 정도로 따로 떨어져 있고 크기가 퍼지거나 너무 작은 것은 피한다. 밀집된 colony는 toxic해져 사용하지 않는다.)

 

10) 3㎖의 LA(액체배지)에 넣고 shaking 하며 room temperature incubation(LA에 tip 그대로 넣는다) ← seed

 

 

 

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