생명공학실험 | Cell Transformation

 

 

 

TIP

 

 

Transformation을 통해 E.coli 에 원하는 DNA를 주입한다.

 

 

 

Competent cell

E. coli를 포함한 대부분의 박테리아는 일반적인 환경에서 극히 제한된 양의 DNA만을 받아들인다. 이러한 종류를 효과적으로 transformation 하기 위하여 박테리아는 DNA를 받아들이는 능력을 향상시키는 물리적, 화학적 형태의 처리가 필요하다. 정상적인 bacteria cell에 이러한 물리적, 화학적 처리를 하여 외부의 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell을 competent cell이라고 한다.

 

Competent cell로 만드는 방법으로는 우선 37℃가 아닌 18℃에서 cell을 키우면 세포막을 빽빽하게 못 만들게 된다(heat shock). 그 후에 칼슘이온으로 처리해서 세포막에 구멍을 만든다. 모든 과정 후 위의 상태를 유지하기 위해서 cell을 -70℃에서 보관한다. (상온에 보관하면 살아있는 cell은 원 상태로 세포막을 복구할 수 있다.) 실험을 할 때는 항상 4℃에서 실험을 하도록 한다. 세포막과 DNA는 모두 -charge를 띈다. 그래서 이 둘의 반발력을 없애려고 칼슘이온을 사용한다.

 

 

Transformation(형질전환)

Transformation이란 세포에 외부 유전자를 삽입해서 세포가 원래의 형질 외의 다른 형질을 갖도록 전환 시키는 것을 말한다. 이와 같이 외부 유전자를 삽입시키려면 세포가 그것을 받아들일 준비가 되어있어야 하는데, 이러한 상태의 세포를 competent cell이라고 한다. 박테리아의 transformation에는 electroporation, CaCl₂-heat transformation(chemical transformation), 그리고 conjugation 등이 있는데 이 중 CaCl₂-heat transformation을 이용할 때 competent cell이 필요하다.

 

heat shock은 CaCl₂가 존재하는 상태에서 시작을 한다. Ca²⁺이온은 lipid의 negatively charged phosphate과 complex를 이루게 된다. 낮은 온도에서 cell membrane을 응고시키게 되면 charged phosphate의 분포를 안정화시켜 Ca²⁺에 의해 효과적으로 shield 될 수 있게 된다. 그리고 이때에 heat shock을 가해 주게 되면, membrane 내외에 thermal imbalance가 생겨나 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다. electroporation에 의한 방법은 세포에 전기충격을 가하여 강한 전기장을 형성시켜서 DNA가 세포 안으로 전달되게 하는 방법이다. 강한 전기장을 순간적으로 걸어주게 되면, 순간적으로 membrane이 깨지게 되고 이때 생성된 구멍을 통해 DNA가 세포 안으로 휩쓸려 들어가게 된다.

728x90

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) -70℃에 보관된 competent cell을 꺼내어 ice에 박아서 녹인 후 10㎕씩 분주하고 DNA 2㎕를 넣어 tapping한다. 이 과정은 clean bench 안에서 수행한다.

Tip 끝을 알콜램프에 살짝 대어 멸균시키고, 손에 의한 열 때문에 competent cell이 녹지 않도록, 그리고 알콜램프 열에도 녹지 않도록 주의한다.

 

2) competent cell이 상온에 있을 경우 cell wall이 만들어져서 활성이 떨어지게 되기 때문에 ice box에 넣어둔다.

 

3) Ice에서 20분 반응한 후 42℃에서 30초간 heat shock을 수고 다시 ice에 5분정도 박아둔다.

 

 

 

[생명공학실험]Cell Transformation 레포트