일반생물학실험 | 세포의 에너지 합성 - 엽록소 분리와 함량 측정

 

 

 

TIP

 

 

1. 종이 크로마토그래피를 이용하여 시금치 잎에서 광합성 색소를 분리하고 색소의 빛 흡수를 알아본다.
2. 분광광도기를 이용한 시료 분석방법을 배운다.

 

 

 

광합성 색소(엽록소)

광합성은 엽육세포의 엽록체라는 소기관에서 수행된다. 엽록체의 내막인 틸라코이드막은 빛에너지를 흡수하는 데에 필요한 광합성 색소 를 가지고 있다. 주요 광합성 색소로는 엽록소 a, 엽록소 b와 카로틴계 색소 등이 있다. 카로틴계 색소에는 β-카로틴, 크산토필, 루테인, 리코펜 등이 있다. 광합성 색소들은 각기 특정한 파장의 빛을 흡수한다. 예를 들면, 엽록소 a는 430㎚ 파장의 빛과 663㎚ 파장의 빛을 최대로 흡수한다. 광합성 색소들은 화학 구조에서 볼 수 있듯이 대부분 지용성 분자들로 여러 가지 유기용매에 녹는 정도가 다르다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 광합성 색소의 분리

① 일정량의 시금치 잎(약 5g)을 아세톤 5㎖에 넣고 막자사발로 곱게 간다.

 

② 이 추출물을 탁상용 원심분리기를 이용하여 원심분리하여(2000rpm에서 5분간) 상등액을 취한 후 침전물을 아세톤 5㎖에 다시 현탁시 켜 막자사발로 갈고 원심분리한 후 상등액을 위의 상등액과 합친다.

 

2) 종이 크로마토그래피를 이용한 엽록체 색소분리

① 여과지를 15X2㎝ 크기로 자른다. 아래 그림과 같이 한쪽 끝에서 1㎝되는 곳을 잘라 삼각형을 만든 다음 이곳으로부터 2㎝ 되는 곳에 연필로 선을 긋는다. 이때 여과지를 손으로 만지지 않도록 한다.

 

② 모세관을 사용하여 준비된 엽록소 추출액을 연필로 그은 선 중앙에 점적한다. 이때 점적한 부분이 가능한 작은 원이 되도록 한다. 헤어 드라이어를 사용해서 완전히 말린 후 4～5회 정도 반복하여 점적한다.

 

③ 핀으로 여과지를 시험관 마개에 매달고 전개용매가 들어 있는 시험관에 넣는다. 여과지가 시험관 벽면에 닿지 않도록 주의하고 전개용 매에 끝에서 0.5㎚정도만 잠기도록 한다.(마개를 완전히 닫지 않으면 전개액이 증발하므로 주의한다).

 

④ 전개액이 여과지 위에서 1.0㎝ 정도까지 전개되었을 때 여과지를 꺼내어 전개액이 전개된 부분을 연필로 표시한 후 여과지를 완전히 말린다.

 

⑤ 점적한 부분에서 가장 가까운 곳의 노란색을 띤 녹색의 밴드가 엽록소 b이고, 그 위에 푸른색을 띤 녹색 밴드가 엽록소 a이며, 그 위쪽 으로 몇 개의 크산토필 밴드가 나타난다. 전개액이 전개된 가장 위쪽의 노란색 밴드가 카로틴이다. 각각의 밴드 Rf값을 다음의 식으로 구한다. 

 

Rf= 특정 색소가 이동한 거리/ 전개액이 이동한 거리

 

⑥ 다른 색소 밴드가 섞이지 않도록 주의하며 엽록소 a밴드를 잘라 내어 시험관에 넣고 아세톤 10ㅢfmf 부어 유리막대로 잘 저어 준다.

 

⑦ Spectronics 20을 이용하여 380㎚에서 700㎚까지의 파장에서 20㎚ 간격으로 흡광도를 측정하여 그래프를 그리고 최대흡수파장을 알아본다.

 

⑧ 위와 동일한 방법으로 엽록소 b의 최대흡수파장도 알아본다

 

3) 엽록소 함량측정

① 시금치 잎에서 추출한 엽록소 a와 엽록소 b 혼합물을 아세톤으로 적당히 희석하고 Spectronics 20을 사용해 645㎚와 663㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

② 앞서 원리에서 소개한 식을 이용하여 엽록소 a와 b의 함량을 구한다.

 

 

 

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