일반생물학실험 | 단백질 추출과 전기 영동

 

 

 

TIP

 

 

1. 전기영동(electrophoresis)은 단백질을 크기차이를 이용하여 구별하는 방법이다. 
2. 본 실험의 목적은 전기영동을 이용해 단백질의 크기를 알아보고, 서로 다른 샘플과 비교하여 그 양상을 비교해보는 데 있다.

 

 

 

단백질의 구조

1. 1차 구조 : primary structure라고도 합니다. 유전자로부터 전사(transcription)를 거쳐 mRNA가 되고, mRNA로부터 해독(translation)된 사슬형 아미노산 서열(linear amino acids)을 말한다. 아미노산간에 공유결합을 이루고 있으며, 이를 펩타이드 결합이라고 한다.

 

2. 2차 구조(secondary structure) : alpha helix, beta sheet, beta turn, random coil등으로 이루어져 있으며, 1차구조가 공간상에서 열역학적으로 가장 안정한 위치를 차지하고 있는 상태를 말한다. 2차 구조와 3차 구조의 경계는 항상 뚜렷하다고는 말할 수 없으며, 3차 구조와 굳이 차별화한다면 활성의 개념이 포함되지 않은 구조를 2차구조라고 할 수 있다.

 

3. 3차 구조(tertiary structure) : 폴리 펩타이드 사슬 1개만으로 이루어진 완전한 3차원적 구조로서, 자체만으로도 100%의 활성을 가지게 된다. 마이오글로빈(myoglobin)과 같은 단백질이 이에 해당한다.

 

4. 4차 구조(quaternary structure) : 2개 이상의 서로 다른 폴리 펩타이드 사슬 또는 서브유닛(subunit)이 모여, 비로소 100%의 활성이 생기는 단백질로서, 3차원적으로 이미 형성된 단백질간에 또는 단백질 서브유닛(subunit)간에 형성되는 복합체의 공간적인 배치(spatial arrangement)를 말하며, 각 도메인(domain)간의 상호작용은 여러 개의 비공유 결합에 의해서 안정화된다. 대표적인 예로는 헤모글로빈(hemoglobin)을 들 수 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) E.coli를 centrifuge하여 cell을 다운시킨다.

 

 

2) supernatant(상층액)를 버리고 pellet(하층에 남은 덩어리)만 남긴 후, sample buffer를 50㎕ 넣어준다. (5x Sample Buffer 조성, 10㎖)

 

3) vortexing or pipeting 하여 pellet을 모두 부순다.

 

4) Water bath에서 5분 가량 끓여준다. (알콜 램프 이용) <100℃/10min권장>

 

5) 10초 정도 centrifuging

 

6) loading (10λ)

 

7) Running (☞ Running시 module의 밑뚜껑을 반쯤 열어준다. 밀폐시 Running이 안됨!)

 

8) 5분 정도 CBB(Coomassie Brilliant Blue R-250) staining.

 

9) Destaining (끓는 물에 5분가량 destaining)

 

10) Gel dry

 

2. gel 조성

A. 7.5% Separating gel (10㎖)	B. 4% Stacking gel (10㎖)
Acrylamide/bis(30/0.8) 2.5㎖ DW(Distilled water) 4.85㎖ 1.5M Tris-HCl, pH8.8 2.5㎖ 10% SDS 0.1㎖ 10% ammonium ersulfate 50㎕ TEMED 5㎕	Acrylamide/bis(30/0.8) 1.3㎖ DW(Distilled water) 6.1㎖ 0.5M Tris-HCl, pH6.8 2.5㎖ 10% SDS 0.1㎖ 10% ammonium ersulfate 50㎕ TEMED 5㎕

 

1) Size Marker (☞ 사용시 marker의 침전으로 인해 vortexing이나 pipeting필요.)

 

Size Marker                                            7.5% Gel의 예

 

3. Coomassie brilliant blue로 SDS-polyacrylamide gel의 염색

1) 0.25g의 Coomassie brilliant blue R250을 10% acetic acid, 45% methanol 혼합용액(staining solution)에 녹인 후, 덜 녹은 시약을 제거하기 위해 Whatman 1번 여과지로 거른다.

 

2) Gel을 적어도 5배 부피에 해당하는 염색액에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서히 흔든다.

 

3) 염색액을 제거한 후 염색약이 포함되지 않은 10% acetic acid, 45% methanol 용액(destaining solution)에 gel을 담가 두어 탈색시킨다.

 

4) 탈색용액을 여러 차례 갈아 주면서 관찰한다. 보통 24시간 탈색을 하면 단일 띠로 0.01mg의 단백질까지 찾아낼 수 있다.

 

5) 탈색 후 gel은 물이 담겨진 플라스틱 백에서 염색된 정도의 변화 없이 무한정 보관할 수 있다. 그러나 저장기간 중 고정된 polyacrylamide gel은 물에 의해 부풀거나 변형될 수 있으므로 이러한 문제를 없애기 위해 고정된 gel을 20% glycerol이 들어 있는 물에 저장을 한다. 염색된 gel은 탈색용액에 저장하면 단백질 띠가 사라질 수 있으므로 탈색용액에 저장해서는 안 된다.

 

6) 영구적인 자료로 사용하기 위해 염색된 gel의 사진을 찍거나 gel을 말린 후 보관한다.

 

4. Protein Gel Casting (Hoefer miniVE)

1) 다음과 같이 Gel sandwich assembly와 module을 조립 한다. module을 조립시, clamp screw를 너무 꽉 조여서 유리판이 깨지지 않도록 주의해야 한다.

 

2) 7.5% Separating gel solution을 glass plate 유리판 쪽으로 3㎝지점까지 붙는다.(약 7㎖ 정도)

 

3) Invitrogen Mark12 unstained standard (Range 2.5-200kDa)

 

4) Gel 위쪽으로 water-saturated n-butanol, water, or diluted gel buffer를 부어서 solution이 공기와 만나는 것을 막는다. (Polymerization시 약 1시간 정도 소요)

 

5) Seperating Gel의 Polymerization이 끝나면 water층과 경계면이 보인다.

 

6) 위의 water층을 제거한다.

 

7) 4% Stacking gel을 붓는다.(약 1.5㎖정도)

 

8) Comb을 꼽는다.

 

9) Stacking Gel의 Polymerization이 완료되면 조심스럽게 Comb을 제거한다.

 

 

 

[일반생물학실험]단백질 추출과 전기 영동 레포트