생명과학실험 | 단백질 발현과 정제

 

 

 

TIP

 

 

1. 단백질 발현의 목적 : 특정 유전자를 통해 얻고자 하는 단백질을 대량 생산할 수 있다.
2. 단백질 정제의 목적 : 단백질을 순도 높게 분리 및 정제함으로써 수많은 단백질 중 원하는 단백질만을 얻기 위함이다.

 

 

 

단백질 발현

재조합 단백질 기법은 외부 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도 입하면 마치 숙주 세포의 유전자처럼 발현되는 기법이다. 알로락토오스와 유사한 IPTG를 이용해 Lac repressor와 결합하게 함으로써 lac operator와의 결합을 방해하 여 전사가 일어나도록 한다. 유전자 과발현 시 단백질의 정제가 쉬워지고 정제의 수율이 올라간다.

728x90

 

 

실험 방법

1. 단백질 발현

1) 알코올램프를 켜고 피펫을 사용해 kanamycin(항생제)을 일부 덜어 SB배양액에 넣고 믹서기로 섞어준다.

 

2) 일회용 Loop으로 콜로니 하나를 따 kanamycin을 미리 넣어놓은 SB배양액에 넣 어준다.

 

3) 배양액을 인큐베이터에 넣고 37℃에서 밤새 흔들어준다.

 

4) 다음날 E. coli가 배양된 것을 더 큰 부피의 용기에 담긴 배양액에 넣어준다.

 

5) 큰 부피의 용기 입구부분을 멸균한 후 배양액에 항생제를 넣어준다. 그 후 다시 용기 입구 부분을 멸균한다.

 

6) 큰 부피의 용기 입구부분을 멸균한 후, 일회용 피펫을 이용해 밤새 배양한 E. coli를 채취하여 큰 부피의 용기에 담긴 배양액에 넣어준 후 다시 용기의 입구를 멸 균시킨다. 공기가 통하도록 용기의 입구 부분을 은박지로 감싼다.

 

7) 배양액을 쉐이킹 인큐베이터에 넣고 37℃로 설정하여 3-4시간 정도 배양한다.

 

8) 큰 용기의 입구를 멸균시킨 후 IPTG를 넣어준 후 배양액 플라스크를 쉐이킹 인 큐베이터에 넣어 18도로 설정하고 밤새 배양한다.

 

9) 새로운 용기를 멸균시킨 후 E. coli 배양액을 집어넣고 다시 용기를 멸균시킨다. 다른 용기에 물을 넣어 양팔저울을 이용해 두 용기의 무게가 같아지도록 맞춰준다.

 

10) 두 용기를 대칭이 되도록 원심분리기에 집어넣고 3500rpm으로 원심분리를 진 행한다.

 

11) 원심분리 결과 E. coli가 용기 밑에 가라앉게 되며 액체 배양액은 버린다.

 

12) wash buffur(20mM imidazol)를 피펫에 덜어 E. coli가 뭉쳐있는 용기에 넣었다 뺐다 반복하며 뭉친 대장균 덩어리를 풀어준 후, 새 튜브로 옮겨 담는다.

 

13) 강력한 초음파 에너지를 이용하여 E. coli를 파쇄한다. 이때 E. coli가 들어있는 튜브는 얼음이 담긴 비커에 넣어준다.

 

14) 원심분리기계를 이용해 13000rpm에서 원심분리를 진행한다.

 

2. 단백질 정제

1) Ni-NTA 비즈가 가라앉아있는 튜브에 20%에탄올을 흘려보낸 후 증류수로 다시 씻어내고 wash buffur(20mM이미다졸)를 흘려보낸다.

 

2) E. coli가 파쇄되고 남은 상층액과 wash buffur(20mM이미다졸)를 차례로 흘려준 다.

 

3) 높은 농도의 이미다졸을 지닌 wash buffur로 정제하고자 하는 단백질을 떼어낸 다.

 

4) 적은 볼륨 ․ 높은 농도의 이미다졸 buffur로 튜브 6개를 차례로 elusion 해준다.

 

5) Ni-NTA 튜브를 재사용하기 위해 wash buffur-증류수-20%에탄올 순으로 씻고 보 관한다.

 

 

 

[생명과학실험]단백질 발현과 정제 레포트