일반생물학실험 | 미생물 유전정보 분석

 

 

 

TIP

 

 

균을 장기간 보관할 수 있는 stock solution와 균을 배양학 위한 LB agar 배지를 직접 제작해본다. 이 과정에서 마이크로피펫을 포함한 다양한 실험 기구들의 사용방법을 익힌다. 또한 PCR과 겔 전기영동의 원리를 이해하고 이를 활용해 배양한 균의 염기서열을 직접 산출해낸다. 산출된 염기서열을 sequencing과정을 통해 미생물의 종을 확인해보며 Hydrolysis test, 그람염색법 그리고 Oxidase, catalase test을 이용해 실험으로 확인할 수 있는 균들의 특징을 확인해 보는 것까지가 이번 실험의 목표이다.

 

 

 

실험 방법

1. 배지 제작 및 미생물 배양

1) 플라스크에 증류수를 150㎖와 LB media 3.75g, Agar 2.25g를 넣는다.(단, LB media와 Agar는 서로 다른 약수저를 사용해 넣는다.)

 

2) 흔들어 섞고, 입구를 호일로 막아 멸균시킨다.

 

3) 멸균된 배지를 식힌 뒤, 페트리 접시에 부어 굳힌다.

 

4) 배지에 지폐(실험에서 사용한 물체)를 살짝 누르는 듯이 찍어준다.

 

5) 페트리접시의 뚜껑을 닫고 밀봉 후 기다린다.

 

6) 균이 자랐으면 single colony 하나를 따서 다른 배지에 획선평판법을 이용하여 다시 배양하며 이 과정을 반복한다.

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2. PCR & 겔 전기영동, BLAST & EZ-Biocloud , Phylogeneic Tree

1) 알코올 램프을 킨 주위에서 실험을 진행한다.

 

2) PCR tube에 멸균 증류수 17λ, 10pmole/㎕ 16s rRNA gene primer mixture 2λ를 넣고 배지에 자란 single colony를 따서 풀어준다.

 

3) PCR 기계에 tube를 넣고 돌린다.

 

4) PCR이 완료되면 겔의 sample wells에 1∼2λ정도 넣고 전기영동 기계를 작동시켜 배양한 미생물의 DNA 염기서열(sequence)를 산출한다.

 

5) BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.go.gov) 에 들어가 산출한 DNA 염기서열을 입력하여 유사 종에 대한 정보를 얻는다.

 

6) 비슷한 방법으로 EZ-BioCloud (https://www.ezbiocloud.net/) 에 들어가 DNA 염기서열로 유사종에 대한 정보를 얻는다.

 

7) EZ-BioCloud에서 얻은 정보를 바탕으로 MEGA라는 프로그램을 통해 Phylogenetic Tree를 만든다.

 

8) Phylogenetic Tree의 계통수를 읽으며 배양한 미생물이 어떤 균에 가장 유사한지를 확인한다.

 

3. 배양한 미생물의 특성 확인

1) 위에서 만든 배지와 비슷한 방법으로 Hydrolysis test용 배지를 만든다.

 

2) (Hydrolysis of DNA) 증류수 200㎖ + DNA Test Agar 8.4g

 

3) (Hydrolysis of Starch) 증류수 200㎖ + LB media 5.0g + Agar 3.0g + Starch 0.4g

 

4) (Hydrolysis of Tween 80) 증류수 200㎖ + LB media 5.0g + Agar 3.0g + Tween80 20㎖ + CaCl2 0.02g(단 , 다른 시약을 계량하여 넣을 때는 반드시 다른 약수저를 사용한다.)

 

5) Hydrolysis of DNA용으로 만든 배지에 균을 배양한 후 HCl을 뿌려서 변화를 확인한다.

 

6) Hydrolysis of Starch용으로 만든 배지에 균을 배양한 후 아이오딘을 뿌려 변화를 확인한다.

 

7) Hydrolysis of Tween80용으로 만든 배지에 균을 배양한 후 균을 확인한다.

 

8) 멸균된 배지를 충분히 식힌 뒤, 페트리 접시에 부어 굳힌다.

 

9) 배양한 미생물의 single colony를 따서 그람 염색법을 이용하여 염색하여 그람 양성을 띠는지 음성을 띠는지 확인한다.(사용하는 염색약 : 크리스탈 바이올렛, 사프라닌)

 

10) 크리스탈 바이올렛으로 먼저 염색 후 아이오딘으로 탈색시킨다.

 

11) 사프라닌으로 다시 염색시킨 후 현미경으로 관찰한다.

 

12) 배양한 균을 페트리접시 뚜껑에 2개로 얇게 펴 바르고, oxidase reagent와 과산화수소를 한 방울씩 떨어뜨리고 결과를 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]미생물 유전정보 분석 레포트