일반생물학실험 | 단백질 정량 분석

 

 

 

단백질 정량

단백질 정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 양, 또는 농도를 구하는 과정이다. 단백질을 가수분해하면 peptide bond가 끊어지면서 아미노산이 유리된다. 보통 peptide나 단백질을 6N HCl 용액이 들어있는 시험관에서 공기를 제거하고 밀봉한 후 100°에서 8-24시간 동안 가열하여 가수분해 시킨다. 이러한 가열조건에서는 모든 peptide bond가 파괴되고 glutamine과 asparagine의 경우에는 side chain의 amide bond도 파괴되게 된다.

 

또한 tryptophan과 serine, threonine 등의 아미노산은 파괴되기 때문에 이러한 단백질을 정량하기 위해서는 특별히 주의를 기울여야 한다. 산성 용액에서 파괴되는 아미노산을 분석하기 위해서는 별도로 단백질을 alkaline-hydrolysis시킨 후 분석한 후에 보정해야 한다. 즉, 단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질의 시료에 있는 다른 성분들의 본질, 정량분석의 신독도 및 정밀도 등에 따라서 적당한 방법을 선택하여야 한다.

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실험 방법

1. 검량선 도출 및 최적 파장대 설정

1) BSA 원액 (2 ㎎/㎖)을 증류수로 희석하여 0, 50, 100, 200 μg/㎖의 BSA 샘플을 제조한다.

 

2) 각 농도의 BSA 용액 200 ㎕ 에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1㎖씩 넣고, pipetting 해준다.

 

3) 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100㎕씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.

 

4) 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.

 

5) 최적의 파장대를 설정하기 위해 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 ㎚의 파장대에서 각 샘플의 흡광도를 측정한다.

 

흡광도를 측정하는 모습

 

6) 최적의 파장대를 설정한 후, BSA standard curve를 도출한다.

 

2. 단백질 농도 측정

1) 미지 농도의 단백질 용액을 준비한다.

 

2) 증류수를 이용하여(1 ㎖) 위 실험에서 설정된 파장대로 UV/Vis spectrophotometer의 Auto-zero를 설정한다.

 

3) 대조군 및 미지의 단백질 용액 200 ㎕ 에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1㎖씩 넣고, pipetting 해준다.

 

4) 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100㎕씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.

 

5) 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.

 

6) 대조군 및 각 단백질 용액을 UV/Vis spectrophotometer를 통해 위에서 설정한 파장대에서 흡광도를 측정한다.

 

7) 주어진 BSA(Bovine Serum Albumine) Standard curve를 이용하여 각 단백질 용액의 농도를 구한다.

 

 

 

[일반생물학실험]단백질 정량 분석 레포트