생화학실험 | DNA purification & DNA Gel Electrophoresis

 

 

 

TIP

 

 

1. DNA, RNA, Protein 등의 혼합물, RNA, Protein과 같은 contaminants를 제거하여 Pure DNA를 얻는다. 
2. 미생물에서 Plasmid DNA를 분리하고 PCR을 이용하여 DNA를 증폭하고, 제한효소를 이용하여 DNA를 절단한 후 Mini gel을 이용하여 전기영동법에 의해 DNA를 분리하고 확인하여 본다. 
3. Plasmid DNA를 이용하여 미생물 형질전환을 한 후 미생물 형질전환체를 선별하는 기술까지 분자생물학을 공부하는데 필수적인 실험 기술을 습득한다.

 

 

 

Plasmid DNA 분리법

원핵세포에는 염색체 DNA 외에도 작은 DNA가 발견된다. 보통 플라스미드(Plasmid)라 불리는 이들 DNA는 염색체 DNA보다 상당히 작고(4kb～100kb) 스스로 복제가 가능하며 대부분 항생물질에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 포함하고 있다. Plasmid DNA란 염색체 밖에 존재하는 DNA(extra chromosomal small circular DNA)이다.

 

Plasmid DNA는 그 자체 내에 replication origin을 가지고 있어서 박테리아 내에서 염색체 DNA 복제와 상관없이 독자적으로 복제되는 특징이 있다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자 뿐 아니라 항생제 합성이나 독물질 합성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀졌다.

 

Plasmid DNA는 순수하게 분리․정제하기가 쉬우며 또 다른 박테리아의 세포 안으로 집어 넣을 수 있다. 이렇게 인위적으로 플라스미드를 다른 박테리아에 감염시킬 수 있기 때문에 이것을 이용하여 유전형질을 변화시킬 수 있다. 형질 변환된 박테리아로부터 plasmid DNA를 분리하는 것은 recombinant DNA를 제조하기 위한 첫 번째 단계이다.

 

Plasmid DNA는 한 세포에서 다른 세포로 옮겨갈 수 있는 성질을 지니고 있으므로 유전자를 옮기는 운반자 혹은 vector로 작용을 한다. 항생제 내성을 지닌다는 이유로 의사들에게는 반갑지 않은 존재로 여겨지지만 분자생물학의 연구에 있어서는 유전자 특성 규명에 없어서는 안될 중요한 수단으로 이용되고 있다. 즉 외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어 주면 이 형질전환된 세포내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA 조각을 cloning하는 vector로 이용될 수 있는 것이다.

 

분자생물학 실험에 사용되는 plasmid는 자연계에 존재하는 plasmid의 특정 부위를 조합하여 만든 plasmid가 이용된다. 이러한 plasmid는 작고 활성이 높은 relaxed replication origin을 가지고 있으며 적어도 항생제 내성에 대한 한개의 유전자를 지니고 있다.

 

또한 이들 plasmid 내에는 한가지 제한효소에 의해 단지 한군데만 절단될 수 있는 부위를 여러개 가지고 있으므로 실험실 내에서의 조작을 쉽게 해주고 있다. Plasmid의 소량분리도 최근 여러가지 kit가 상품화되어 있으며 많은 sample을 동시에 빠르고 간편하게 분리할 수 있는 장점은 있지만 경제적이지 못하기 때문에 여기에서는 보통 쓰는 alkali lysis 방법을 기술하기로 하겠다.

 

 

실험 방법

1. Cell Lysis : Harvesting

① 멸균처리된 1.5㎖의 tube에 2㎖의 single bacteria colony를 넣고 37℃에서 하루동안 strring을 해준다.

 

② 1.5㎖를 microfuge tube에 넣고 4℃에서 30초 동안 12000g으로 원심분리기에 넣는다.

 

③ suction을 통해서 중간부분을 제거하고 물기를 최대한 줄인 침전물을 얻는다. → 이 과정을 통해 정제하고자 하는 DNA가 포함된 세포를 얻을 수 있다.

 

2. Alkali lysis method : Lysis by alkalie

① harvesting 3rd step에서 얻은 bacterial pellet을 200㎕의 ice-cold된 용매Ⅰ에 넣고 vortex한다. 

 

② 200㎕의 용매Ⅱ를 mixing한 후 vortex한다.

 

③ 200㎕의 ice-cold된 용매Ⅲ를 mixing한 후 vortex한다.

 

④ 12,000g으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 시키고 위에 떠 있는 물질을 tube에 옮긴다. 

 

⑤ Optional : 같은 양의 phenol과 chloroform을 넣어준다.(protein이 침점된다.)

 

⑥ 이중나선구조의 DNA와 2부피만큼의 ethanol을 섞어서 실온에서 침전시킨다. vortexing을 통해서 서로 섞고 ice box에서 2분 정도 방치한다.

 

⑦ 12,000g에서 4분 동안 4℃로 원심분리 시킨다. 이 과정에서 DNA가 농축되므로 원심분리를 시키면 ethanol과 DNA가 분리된다.

 

⑧ 200㎕ wash buffer를 넣고 vortex 한 후 1분간 centrifuge하여 상층액(ethanol)을 버린다. wash buffer는 씻어주는 역할을 한다.

 

⑨ 300㎕ 4℃에서 70% ethanol를 넣고 vortex 한 후 1분간 centrifuge하여 상층액을 버린다. 

 

⑩ 50㎕의 DNA분해효소가 없는 췌장 RNA분해효소를 포함하고 있는 TE(pH 8.0)에 다시 녹인다. 잘 흔들어서 -20℃에서 보관한다. 여기서 RNA는 분해되고 DNA만 남게 된다.

 

⑪ T.D.W 50㎕를 넣고 vortex 한 후 10분 동안 4℃에서 centrifuge한다.

 

⑫ 상층액을 500㎕ tube에 옮겨 cetrituge 한 후 gel electrophoresis한다.

 

3. DNA Purification

① Ampicillin이 60㎕/㎖로 첨가된 LB 또는 TB 배양액 3㎖에 박테리아의 colony를 접종하여 37°C 배양기에서 하룻밤동안 흔들면서 키운다.

 

② 미세원침관에 빅테리아가 완전히 자란 배양액을 1.5㎖ 담고 15,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 박테리아를 침전시킨다.

 

③ 상층의 배양액을 완전히 제거하고 남은 균용액을 다시 넣어서 침전시킨다.

 

④ 박테리아 침전물에 용액 1을 200㎕ 넣고 진탕하여 부유시킨다.

 

⑤ 용액 2를 200㎕ 첨가하고 뚜껑을 막은 후 시험관을 천천히 5회 정도 뒤집었다 세웠다를 반복하여 혼합한 뒤 5분간 상온에 둔다. 이때 절대로 진탕과 같이 거친 방법으로 혼합해서는 안된다.

 

⑥ 용액 3을 200㎕ 첨가하고 손가락 끝으로 툭툭 쳐서 잘 섞은 후 얼음 속에 10분간 보관한다.

 

⑦ 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원침시킨 후 상층액(550～600㎕)을 새 미세원침관으로 옮겨 담는다. 가능한 한 하얀 침전물이 섞이지 않도록 한다.

 

⑧ 옮겨 담은 상층액에 0.6～1배 부피의 isopropanol을 첨가하여 혼합한 후 상온에 20분 정도 둔다.

 

⑨ 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상층액을 완전히 제거한다.

 

⑩ RNase A가 50μg/㎖ 함유된 TE, pH 8.0 용액 20～100㎕를 가하여 DNA 침전을 녹인다.

 

⑪ 37°C에서 20～30분간 방치한다.

 

⑫ 동량의 1.6 M NaCl/13%(w/v) PEG 8,000(polyethylene glycol)을 첨가하고 4°C에 10분 두었다가 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 완전히 제거한 다음 TE, pH 8.0 용액 100 ㎕에 침전물을 녹인다.

 

⑬ 동량의 phenol / chloroform / isoamylalcohol(25:24:1)용액을 넣고 진탕한 다음 2분간 원심분리하고, 상층액을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 과정을 2～3번 반복하여 단백질을 제거하도록 한다.

 

⑭ 0.1 부피의 3 M sodium acetate, pH 5.2와 2.5 부피의 순수한 ethanol을 첨가하고 -20°C에 20분 이상 두어 DNA를 침전시킨다.

 

⑮ 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 완전히 제거한 다음 70% ethanol을 200～500㎕ 넣고 다시 원심분리하여 세척한다.

 

⑯ 상층액을 완전히 제거하고 뚜껑을 연채로 5분 정도 말린다음 원하는 양의 TE, pH 8.0 용액 또는 증류수에 녹인다.

 

4. DNA Gel Eletrophoresis

① 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.

 

② 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다. 

 

③ Microwave oven를 이용하여 agarose가 녹을 때까지 서서히 가열한다.

 

④ 용액을 60°C까지 식힌다. 필요하면 ethidium bromide를 최종농도 0.5 μg/㎖이 되도록 가하고 잘 혼합한다.

 

⑤ Comb을 agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5∼1.0㎜정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 고정시킨다.

 

⑥ 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붇는다. Gel은 3∼5㎜ 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.

 

⑦ 실온에서 20∼30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.

 

⑧ Gel을 1 ㎜ 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 전기영동 완충용액(1x TAE)을 가한다.

 

⑨ DNA 시료를 전기영동용 loading 완충용액과 혼합한 후 pipette을 이용하여 잠겨있는 gel의 홈에 혼합액을 조심스럽게 가한다.

 

⑩ Gel tank의 뚜껑을 닫고 DNA가 양극 쪽으로 이동해갈 수 있도록 양극에 빨간 도선을, 음극에 검정 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1㎝당 1∼5V의 전압을 가한다.

 

⑪ 전기영동이 끝나면 전기를 끄고 도선을 제거한 후 gel tank의 뚜껑을 연 다음 gel을 자외선하에서 관찰하고 촬영한다.

 

 

 

[생화학실험]DNA purification & DNA Gel Electrophoresis 레포트