일반생물학실험 | 현화 식물의 염색체 진화

 

 

 

유전 정보를 담고 있는 유전 물질은 세포 안의 핵에 존재한다. 핵에는 생물에 따라 고유한 개수의 염색체가 존재하는데, 이 염색체에 유전 정보가 저장된다. 염색체는 DNA가닥과 단백질로 이루어진 DNA와 단백질 복합체이다. DNA가닥이 히스톤 단백질에 감겨 뉴클레오솜 구조가 만들어지면, 실에 꿰인 구슬 모양의 가닥이 형성되고, 이 가닥이 규칙적으로 꼬여 더 두꺼운 가닥이 만들어진다. 각각의 염색체는 하나의 긴 이중 나선 DNA로 구성되어 있고, 이 DNA 가닥의 여러 부분에 생명체의 특정 형질을 결정하는 유전 정보가 저장되어 있다.

 

분열 중에는 염색체가 많이 응축되어 있어 광학현미경으로 관찰하면 염색체 수, 크기, 형태적 특징 들을 확인할 수 있다. 분열 중기에 나타나는 염색체의 수와 모양, 크기의 특징을 핵형이라고 한다. 핵형은 생물에 따라 정해져 있으며, 이러한 핵형을 조사하는 작업을 핵형 분석이라고 한다. 핵형은 크기와 모양 그리고 염색체에 존재하는 띠 유형에 따라 염색체를 정렬하여 분석한다

 

분열기 중기에 염색체가 가장 뚜렷하게 관찰되므로, 이 시기의 염색체를 이용하여 핵형을 분석한다. 중기의 염색체가 핵형 분석에 가장 좋다. 따라서 핵형 분석을 위해서는 전처리를 하는데 보통 방추사의 형성을 억제시켜 많은 세포가 중기에 머물도록 한다. 동원체는 두 자매 염색분체가 결합하고 체세포분열과 감수분열 중에 방추사 미세소관이 부착되는 곳이다.

 

동소적 종분화에서는 모종과 같은 지리적 영역 내에서 새로운 종이 생겨난다. 배수체, 서식지 분화, 성선택 등은 개체 수가 늘어날 수 있는 요인이다. 많은 식물 종들은 세포분열 중 발생하여 염색체들의 추가 집합이 생길 때 발생하는 동소적 종분화에서 유래했다. 이러한 방식으로 형성된 새로운 종은 배수체인데, 이는 그들의 세포가 두 개 이상의 완전한 염색체를 가지고 있다는 것을 의미한다.

 

Secondary constriction은 동원체의 염색체 이외의 염색체 지점에서 발견되는 수축 또는 좁은 영역이다. 염색체는 일차 수축 부위에서만 구부러 질 수 있기 때문에 두 수축 사이의 차이는 후기에 눈에 띈다. Secondary constriction은 염색체를 식별하는 데 유용하다. 현화식물의 뿌리와 꽃에서 염색체를 관찰하고 핵형분석을 하면서 염색체 수, 특정 유전자 위치, 염색체의 크기 등이 분류학적으로 또, 진화학적으로 어떤 정보를 제공하는지와 다배체 현상이 진화학적으로 어떤 영향을 주는지를 알아보는 것이 이번 실험의 목표이다.

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실험 방법

1. 전처리 단계가 미치는 영향을 알아보기 위하여 양파를 전처리하지 않은 대조군 (basic karyotype Feulgen)

1) root meristem을 준비하여 정단분열조직만 획득한다.

 

2) 얇게 dissection한 이후 60% acetate를 처리한다.

 

3) root tip을 5N HCl에 넣어주고 30분 정도 상온에서 보관한다.

 

4) tap water로 2번정도 washing한다.

 

5) meristem part만 염색되는 Schiff’s reagent시약에 넣어주고 암실에서 대략 1시 간 보관한다.

 

6) 염색된 염색체들을 관찰할 수 있다. 각각의 염색체들을 잘라서 크기에 따09라 상 동염색체 쌍으로 배열해준다.

 

2. 전처리 단계가 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리한 단자엽 양파

1) 방추사의 활동을 억제하기 위해 colchicine을 담은 용액에 획득한 뿌리 부분을 담 군다.

 

2) 4시간 30분 정도 암실에서 상온에 보관한 후, 물로 2번 정도 워슁한다.

 

3) ethyl alcohol, acetic acid를 3:1의 비율로 넣어주어 고정하고, 암실에 2시간 둔 다.

 

4) 하루가 지나도록 두고 root tip 연화과정을 거친다.

 

5) 5N의 hidrochloric acid solution(HCl)에 넣어 OH기를 제거한 후, 독성에 주의하 여 30분 정도 실온에 둔다.

 

6) 시약을 제거한 후, tap water로 2번 정도 washing한다.

 

7) Schiff’s reagent로 암실에서 1시간 보관하여 염색한다.

 

8) 핑크색으로 염색된 뿌리의 정단분열 조직을 꺼내서 acetic acid를 처리한다.

 

9) 슬라이드글라스에 라벨링하고 핀셋으로 염색된 뿌리를 얹는다.

 

10) 진한 핑크색으로 염색된 부분만 남기고 나머지를 제거한 후, filter paper로 주변 을 닦아 dust를 제거한다.

 

11) 슬라이드 글라스에 올려진 잘 염색된 진한 핑크색 부분을 잘게 부순다.

 

12) 60%의 acetic acid(염색체를 제외한 세포내 기관들을 파괴하기 위함)를 10ul 넓 게 흩뿌리고 커버슬릿으로 닫는다.

 

13) needle 뒷부분으로 두드려준다.

 

14) 필터 페이퍼를 커버슬릿에 완전히 덮고 한쪽 손으로 고정시킨 후, 강하게 꾹 눌러 셀들을 펼친다.

 

3. 뿌리의 염색체 관찰 요약

1) 양파 뿌리 끝을 채집한 뒤 washing을 해준다.

 

2) 1개는 Colchicine에 넣어 암실에서 4시간 반 정도 보관하고 다른 한 개는 Ethyl alchol과 Acetic acid를 3:1 비율로 섞은 용액에 넣어 고정시켜준다.

 

3) Colchicine에 넣어 둔 것은 4시간 반 후, washing을 해서 다른 한 개와 마찬가지로 Ethyl alchol과 Acetic acid를 3:1 비율로 섞은 용액에 넣어 고정시켜준다.

 

4) 하루가 지난 다음 날, 고정시킬 때 사용한 시약을 제거하기 위해 고정된 뿌리를 꺼내 수분을 제거하고 5mol/L-Hydrochloric acid solution가 담긴 시약통에 넣고 30분 간 실온에 둔다.

 

5) 30분 담궈놓은 후, 통에 들어있는 시약을 스포이드로 빨아아들여 폐시약통에 버리고 물을 넣어 폐시약통에 스포이드로 다시 버리는 수세 작업을 2번 정도 해준다.

 

6) Shiff’s reagent를 직접적으로 넣어주고 암실에서 1시간 보관해준다. 애기나리, 무룻과 꿀풀의 뿌리도 이와 같은 과정으로 염색한다.

 

7) 슬라이드글라스에 라벨한 후 현미경 위에 올려두고 핀셋을 이용하여 뿌리를 슬라이드 글라스 위에 올린다.

 

8) 정단분열조직을 제외한 나머지 부분을 제거하고 filte paper를 이용하여 여분의 dust와 용액을 제거한다.

 

9) 이차원적인 관찰을 위해 잘거 부수고 피펫으로 10μL정도의 60% Acetic acid를 넣어준다.

 

10) 잘 흩뿌려준 다음, 커버글라스로 덮고 filter paper로 한 쪽 면을 덮고 손으로 눌러 니들 뒷 부분으로 두드려준다.

 

11) filer paper를 커버 위에 완전히 덮고 한쪽 손으로 고정하고 커버글라스 위를 엄지로 세게 누른다.

 

12) 광학 현미경으로 관찰한다.

 

4. 쌍자엽 식물인 국화과 분치

1) 단자엽 양파를 처리했던 것과 동일한 방법으로 처리한다(실험 나.과 같은 루트를 탄다).

 

2) 앞의 1),2) 과정에서 colchicine가 아닌 8-hydroxy quinoline을 이용하여 전처리한다. (쌍자엽의 식물들은 단자엽과 다르게 뿌리도 얇고 염색체의 크기가 작아 이에 더욱 잘 맞는 다른 시약을 사용해야 하는 것이다.)

 

3) 8-hydroxy quinoline 시약에 담궈 2시간 30을 상온인 암실에서 보관한다. 다시 2 시간30 동안 4‘C에서 보관하고, 물로 2번 정도 워싱한다. 이후는 실험 나의 3)부터의 방법 을 따른다.

 

5. 기생식물의 꽃

1) 기생식물은 뿌리에서 활발하게 세포분열이 일어나지 않으므로 뿌리 대신 꽃을 사용 한다. 아직 화분 생성이 한창인 감수분열하는 미성숙한 꽃을 대상으로 한다. 이 작업은 광학현미경이 필요해서 hood 안에서는 못한다.

 

2) 왼쪽은 이미 성숙해서 모든 약과 암술, 수술이 방출된 화서인데에 반해 오른쪽은 이 제 성숙되어지는 과정이라 감수분열이 왕성하게 일어나는 상태에서 고정이 된 것이다. 무언가 내부를 채우고 있는 것이 확연히 다르게 보인다. 이것을 절개하여 5N HCl에 넣고 30분 동안 상온에서 보관한 후, 두 번 정도 워싱하여 Schiff’s reagent 넣고 암실에서 보관한다. 이 부분들은 위의 다른 실험체들과 동일하다.

 

6. 꽃의 염색체 관찰 요약

1) 해부현미경을 통해 꽃을 보고 미성숙한 부분의 꽃을 절개한다.

 

2) 뿌리와 동일한 방법으로 염색한다.

 

3) 5mol/L-Hydrochloric acid solution를 넣고 상온에 30분 간 보관한다.

 

4) 30분 담궈놓은 후, 통에 들어있는 시약을 스포이드로 빨아아들여 폐시약통에 버리고 물을 넣어 폐시약통에 스포이드로 다시 버리는 수세 작업을 2번 정도 해준다.

 

5) Shiff’s reagent를 직접적으로 넣어주고 암실에서 1시간 보관해준다.

 

6) 슬라이드글라스에 라벨한 후 현미경 위에 올려두고 핀셋을 이용하여 꽃을 슬라이드 글라스 위에 올린다.

 

7) filte paper를 이용하여 여분의 dust와 용액을 제거한다.

 

8) 이차원적인 관찰을 위해 잘거 부수고 피펫으로 10μL정도의 60% Acetic acid를 넣어준다.

 

9) 잘 흩뿌려준 다음, 커버글라스로 덮고 filter paper로 한 쪽 면을 덮고 손으로 눌러 니들 뒷 부분으로 두드려준다.

 

10) filer paper를 커버 위에 완전히 덮고 한쪽 손으로 고정하고 커버글라스 위를 엄지로 세게 누른다.

 

11) 광학 현미경으로 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]현화 식물의 염색체 진화 레포트