분자생물학실험 | Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR)

 

 

 

TIP

 

 

추출된 RNA로 합성한 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 진행하고, 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교하여 sample을 평가한다.

 

 

 

Housekeeping gene의 이용

housekeeping gene이란 세포에서 높은 수준으로 항상 발현되어 유지되는, 세포 생명활동에 필수적인 기능을 수행하는 유전자의 총칭이다. 외부 자극에 의해 발현이 크게 변하지 않는 특성이 있으며 대표적으로 액틴 단백질, 리보솜 단백질, GAPDH(Glyceraldehyde –3-phosphate dehydrogenase) 등이 있다.

 

housekeeping gene은 높은 수준으로 발현되는, 즉 실험에서 넣어준 만큼 발현되기 때문에 PCR에서 특정 유전자의 전사 발현을 양적으로 비교할 때 대조군과 실험군에서 총 RNA 양이 동일하게 사용되었다는 것을 증명하기 위해 housekeeping gene을 사용한다. 대조군과 실험군에서 housekeeping gene의 mRNA양이 동일할 때 실험군에서 특정 유전자 전사 발현의 양적 변화를 설명할 수 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 20㎕ cDNA sample에 D.W 80㎕를 넣어 1/5로 희석해준다.

 

2) RNA를 기반으로 제작된 cDNA를 아래와 같이 혼합한다.

 

2x Q Master premix --------- 10㎕

cDNA ---------------------- 5㎕

primer ---------------------- 5㎕

_________________________________

20㎕

 

3) 혼합한 용액을 qPCR machine을 통하여, 아래와 같은 온도로 설정하여 qPCR을 진행한다.

 

[95‘C / 3min]

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[95’C / 20sec – 58’C / 20sec – 72’C / 20sec] x 40cycle

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[72’C / 3min]

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[95’C – 65‘C – 95’C ]

 

 

 

[분자생물학실험]Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR) 레포트