생명과학실험 | pGal을 활용한 대장균 형질전환

 

 

 

TIP

 

 

Plasmid DNA에 의한 박테리아 형질전환을 할 수 있으며 파란색의 박테리아 콜로니의 존재로 Lac+형질을 설명하는 것이다.

 

 

 

박테리아의 형질 전환

박테리아의 형질전환은 박테리아 세포 내로 플라스미드 DNA를 투입해주는 작업을 의미한다. 세포가 세포막을 통해 외부 DNA를 직접 받아들이고, 형질 도입 및 접합을 통해 박테리아의 형질 전환이 일어난다.

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실험 방법

1. 실험 과정

형질 전환 실험 전, LB Agar 플레이트 준비 및 대장균 소스 플레이트 준비 과정이 필요하다. 각각의 과정은 다음과 같다.

 

1) LB Agar 플레이트 준비

① 고체 ReadyPour LB Agar를 누르고 흔들어 작게 부순다.

 

② 뚜껑을 일부 열어 가열되는 동안 수증기가 빠지지 않도록 한다.

 

③ 전자레인지에 60초간 넣어 Agar를 녹이고 꺼내어 병을 돌린다. 다시 30초간 전 과정을 반복하다. 이 과정을 Agar가 완전히 용해될 때까지 반복한다.

 

④ 완전히 용해가 되었다면 60℃까지 식힌다.

 

⑤ 식는 동안 20개의 페트리 접시에 마커로 줄을 표기한다. 10개는 X-Gal/Amp로 표기하고, 10개는 X-Gal/대조군로 표기한다.

 

⑥ 식힌 Agar 20㎖씩을 다섯 개의 페트리 접시에 각각 넣는다.

 

⑦ X-Gal 용액을 해동시켜 식힌 ReadyPour Agar에 넣는다. 병 뚜껑을 닫고 흔들어 섞는다.

 

⑧ 5㎖ Agar를 X-Gal/대조군 1 에 넣는다

 

 

⑨ 암피실린을 남은 ReadyPour Agar 병에 넣는다. 뚜껑을 닫고 흔들어 섞는다.

 

⑩ 5㎖의 X-Gal/Amp을 X-Gal/Amp로 표기한 20개의 페트리 접시에 넣는다.

 

⑪ 뚜껑을 닫고 20분 이상을 기다려 LB-Agar가 굳힌다. 페트리 접시를 상온에서 하루 동안 놓는다(이틀 이상 지나지 않도록 한다).

 

⑫ 완전히 마르지 않도록 뒤집어 놓는다.

 

2) 대장균 소스 플레이트 준비

① 멸균된 루프를 사용하여, 약병에서 BactoBead를 떼어낸다. LB 소스 플레이트의 끝에 옮긴다. 사용한 후에, 뚜껑은 즉시 닫는다.

 

② 10㎕의 멸균된 물을 첨가해 용해한다.

 

③ 용해된 BactoBead를 스트리킹한다(배지가 찢기지 않도록 주의한다).

 

④ 반대 방향으로 스트리킹한다.

 

⑤ 페트리 접시를 돌려가며 여러 방향으로 스트리킹 한다.

 

⑥ 뚜껑을 덮어 37℃에서 16～20시간 배양한다.

 

⑦ 각각의 LB 소스 플레이트를 위의 과정과 동일하게 진행한다.

 

3) 위의 과정을 거친후, 다음과 같은 방법으로 형질전환 실험을 진행할 수 있다.

① 2개의 마이크로튜브에 각각 "+DNA", "-DNA"로 라벨을 붙인다.

 

② 1㎖ 피펫을 사용하여 500㎕ 얼음 냉 CaCl₂ 용액을 "-DNA" 튜브에 넣는다.

 

③ 이쑤시개를 사용해 약 15개의 군집을 대장균 배지에서 "-DNA" 튜브로 옮긴다.

 

④ 이쑤시개를 손가락 사이에서 비튼다. 염화칼슘 용액에 있는 박테리아 세포를 재부유 시킨다. 볼텍싱한다.

 

⑤ 세포 부유액의 250 ㎕을 "+DNA"라고 표시된 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 놓는다.

 

⑥ pGal 10㎕을 "+DNA" 라벨 튜브에 넣는다. "-DNA" 라벨 튜브에 10㎕ 대조군 버퍼를 첨가한다.

 

⑦ 10분 동안 튜브를 얼음 위에 배양한다.

 

⑧ 형질 전환 튜브를 42℃의 물이 담긴 욕조에 90초간 놓는다.

 

⑨ 즉시 튜브를 얼음에 넣고 2분간 배양한다.

 

⑩ 1㎖ 피펫을 사용해 배지의 250㎖를 각 튜브에 옮긴다. 튜브를 돌려 부드럽게 혼합한다.

 

⑪ 30분 동안 37℃의 수조에서 세포를 배양한다.

 

⑫ 세 개의 한천 배지 접시 바닥에 다음과 같이 라벨을 부착하십시오.

X-Gal / 대조군 1(스트라이프가 없는)

Amp / X-Gal / 대조군 2(스트라이프 1개가 있는 플레이트)

Amp / X-Gal / pGal(스트라이프가 하나 있는 플레이트)

 

⑬ 수조에서 튜브를 꺼내 실험실 벤치에 놓는다.

 

⑭ 1㎖ 피펫을 사용하여 "-DNA" 라벨 튜브에서 X-Gal/대조군 1 접시 및 Amp/X-Gal/대조군 2 접시의 중간으로 100㎕ 세포를 옮긴다.

 

⑮ 접종 루프를 이용하여 판 전체에 세포를 펴 바른다. 접시를 덮고 5분간 기다린다. 그리고 판을 서로 겹겹이 쌓아 테이프로 붙인다. 접시에 그룹 번호로 레이블을 지정하십시오. 37℃의 향온기에 접시가 뒤집히도록 놓는다. 마지막으로 각 판의 군집 수와 박테리아의 색을 관찰한다.

 

 

 

 

 

[생명과학실험]pGal을 활용한 대장균 형질전환 레포트