세포생물학실험 | Estimation of Protein

 

 

 

TIP

 

 

단백질이 포함된 미지의 시약에 담긴 단백질의 총량을 알아낸다.

 

 

 

Lowry's method

알칼리성에서 단백질의 펩타이드 결합과 구리가 반응해 Cu²⁺ 이온을 생성하는 뷰렛반응 원리를 이용한 방법이다. 구리이온의 화학변화에 영향을 주는 화합물이 존재할 경우 단백질 정량 측정을 간섭하게 되는데, 이를 위해 분적 전에 제거하거나 영향이 없을 정도로 희석하여야만 한다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 실험에 사용할 용액들을 제조한다.

① Working standard 제조

- Bovin serum albumin 10㎖를 증류수 100㎖에 용해시킨다.(stock solution)

- Stock solution 10㎖를 증류수 100㎖에 희석시킨다.

 

② Folin’s phenol 시약 제조

- Folin’s phenol을 증류수와 1:2 비율로 혼합한다.

 

③ Alkaline CuSO₄ Reagent

A. 1N의 sodium hydroxide에 Sodium carbonate를 첨가하여 2%의 용액을 만든다.

B. Sodium potassium tartrate를 1%농도로 제조한다.

C. 황산구리 0.5% 용액을 만든다.

D. A, B, C의 용액들을 50:1:0.5의 비율로 혼합한다.

 

2) 아래의 표와 같게 테스트 튜브에 working standard 용액을 첨가한다.

 

3) Sample시약을 0.2㎖과 0.4㎖를 각각 T₁과 T₂에 넣는다.

 

4) 각 시험관에 증류수를 넣어 총 용량을 1㎖로 통일시킨다.

 

5) 각 시험관에 4.5㎖의 complex-forming시약(alkaling CuSO₄시약)을 넣고 실온에서 10분간 반응을 진행시킨다.

 

6) 각 시험관에 0.5㎖의 Folin시약을 넣고 실온에서 30분간 반응을 진행시킨다.

 

7) 반응 후에 스펙트로미터를 통해 640㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다.

 

8) 단백질의 농도에 따라 Blank와 표준시약들의 흡광도를 비교하여 그래프를 작성하고, 그래프에서 sample의 단백질 농도를 결정한다.

 

 

 

[세포생물학실험]Estimation of Protein 레포트