세포생물학실험 | pH 변화에 따른 Enzyme의 Activty

 

 

 

실험 방법

1. Buffer 용액제조

1) 먼저 KH₂PO₄와 K₂HPO₄를 각각 50mM 80㎖를 제조한다.

➀ 시약스푼을 사용하기 전 알코올로 소독한 뒤 종이타월로 닦아준다.

➁ KH₂PO₄ 0.55g 을 저울로 측정한다. 한번 꺼낸 시료는 다시 담지 않는다.

➂ 비커와 실린더를 사용하기 전 D.W 로 세척 한다.

➃ 100㎖ 실린더에 80㎖ 의 D.W를 담고 비커에 옮겨 담는다.

➄ 비커에 80㎖용량을 눈금으로 표시한 후 실린더에 적정량을 덜어놓는다.

➅ 비커에 KH2PO4시료를 넣고 D.W로 시료용지에 남은 시료까지 비커에 넣는다.

➆ 덜어둔 d.w를 이용하여 비커의 눈금을 맞춰준다.

➇ 알코올로 소독한 유리막대를 이용하여 섞어준다.

 

2) 각각 용액을 40㎖로 나눈 뒤 pH meter를 이용하여 pH5와 pH7을 만든다.

➀ 만들어진 80㎖ 의 용액을 40㎖씩 나눠 담고 라벨링 한다.

➁ pH meter의 유리 전극을 사용 전에 D.W로 세척한 뒤 살짝 닦아 낸다. 유리전극을 base 용액에 담가둔다.

➂ pipette 을 이용하여 base용액에 다른 용액을 조금씩 넣어주면서 pH값을 맞춰준다.

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2. pH 변화에 따른 Enzyme의 Activty

1) 만들어 놓은 pH3, pH5, pH7 Buffer를 준비한다.

 

2) α-amylase 100㎕를 따서 E-Tube에 넣는다.

 

3) Tube에 500㎕의 Buffer를 더 넣는다.

① α-amylase(enzyme) 1000㎕, pH3 1000㎕ 를 1000㎕ 피펫으로 받아온다.

② 받아온 enzyme 을 각각 3개의 E-tube 에 100㎕ 씩 담는다.

③ pH3, pH5, pH7 을 500㎕씩 담는다.

④ E-tube를 vortex를 이용하여 vortexing 시켜준다.

 

4) 37℃에서 15min lncubation 시킨다.

 

5) 1% Starch 500㎕를 각각 Tube에 넣는다.

 

6) 37℃에서 15min lncubation 시킨다.

 

7) DNS reagent 200㎕를 각 Tube에 첨가한다.

 

8) 100℃ 끓는물에 10min 넣어둔다.

① 반응색을 확실히 보기위해 가열한다.

② 약간 진한 노랑색이 적갈색으로 선명해진다.

③ DNS reagent + 말토오즈 = 적갈색

④ 끓는 물로 인해 튜브의 뚜껑이 열리는 문제가 발생하였다.

⑤ 뚜껑을 고정하는 것을 이용하면 이런 상황을 막을 수 있다.

⑥ 알콜램프가 가열도중 꺼졌다 - 알콜램프 속 메탄올 이 없어서 일어났다. 다시 보충

 

9) 540nm에서 SpectropHotometer로 흡광도를 측정한다.

① Absorption cell에 1000

② SpectropHotometer에 D.W 1㎖ 를 넣고 기준점을 0으로 맞춘다.

③ SpectropHotometer 안에 cell을 넣을 때는 화살표 방향을 확인한 뒤 넣는다.

 

 

 

[세포생물학실험]pH 변화에 따른 Enzyme의 Activty 레포트