일반생물학실험 | 단백질 추출 및 정량

 

 

 

TIP

 

 

Cell에서 단백질을 추출하고 Bradford assay를 통해 이를 정량한다.

 

 

 

Coomassie Brilliant Blue G-250

Bradford mathod에서 사용되는 염료이다. 산성 조건 하에서 갈색인 반면, 단백질과 결합하면 전체적으로 음전하를 띠며 푸른색으로 변하게 된다. 또한 이러한 성질 때문에 Polyacrylamide gel electrophoresis를 사용하여 단백질 또는 단백질 복합체를 분리하는데 사용할 수 있다.

 

단백질 농도가 많을수록 더욱 진한 파란색을 띤다. Coomassie Blue가 단백질에게 전자를 주어 단백질의 중성 상태를 무너뜨리면 단백질의 소수성 부위가 노출되는데, 노출된 부분에 Coomassie Blue가 비공유 결합을 이룬다. 또한 양전하를 띠는 아민기는 Coomassie Blue의 음전하 부위와 가깝게 위치를 조정하게 되고 이 부분에서의 이온결합은 Coomassie Blue와 단백질 사이의 결합을 강화시키는 역할을 하여 푸른색을 띠는 형태를 더욱 안정시킨다.

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실험 방법

1. Tris-Triton lysis buffer 조성

1) 10 mM Tris (pH 7.4)

 

2) 100 mM NaCl

 

3) 1 mM EDTA

 

4) 1 mM EGTA

 

5) 1% Triton X-100

 

6) 10% Glycerol

 

7) 0.1% SDS

 

2. 단백질 추출 및 정량

1) Cell pellet에 Tris-Triton lysis buffer를 100 ㎕ 추가 후 sonication.

 

2) Cell lysate를 4℃에서 5분간 13000 rpm으로 centrifuge.

 

3) 상층액을 새로운 1.5 ㎖ tube에 옮긴다.

 

4) BSA를 희석하여 0, 0.5, 0.75, 1, 1.5 ㎎/㎖ 농도의 standard solution을 제작한다.

 

5) Bradford Reagent 200 ㎕에 standard solution 5 ㎕, 그리고 cell lysate 1 ㎕를 각각 넣어준 뒤 차광시킨 상태에서 15～45분간 반응시켜준다.

 

6) 96 well plate에 반응시킨 용액 200 ㎕를 넣어준 뒤 microplate reader로 595 ㎚ 흡광도를 측정하여 protein 농도를 측정한다.

 

 

 

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