미생물학실험 | 단 염색 (Simple staining)과 그람 염색 (Gram Stain)

 

 

 

TIP

 

 

단염색은 한 종류의 염료(dye)를 사용하여 세균의 형태, 배열, 크기 등을 신속히 관찰하는데 목적이 있고, 그람 염색은 그람 염색법에 의해 세균감별염색술 식을 익히고 세균그람염색성에 따른 분류와 그람 염색의 원리를 익힌다.

 

 

 

미생물은 크기가 매우 작고, 분포밀도가 작아 육안으로 관찰 및 연구하기 어려운 생물이다. 따라서 이를 관찰하기 위해서는 미생물을 배양해서 분포밀도를 늘리거나, 현미경을 통해서 미생물을 확대하여 관찰이 가능하다. 이 실험에서는 현미경을 통해 미생물을 관찰할 것이다.

 

현미경을 통해 미생물을 관찰할 때 염색을 해야 하는 이유는 명시야 현미경의 제한요소 중 하나인 불충분한 대비차를 염색을 통하여 세포의 대비를 증가시켜 명시야 현미경으로도 쉽게 관찰할 수 있게 된다. 즉, 염색을 하지 않고 관찰하면 미생물과 배경의 경계 구분이 불분명하게 관찰 되는데 염색을 함으로써 이러한 문제가 해결된다.

 

염색의 방법에는 단염색, 그람염색, 내생포자 염색, 편모염색 등이 있는데 대부분의 염색 원리는 동일하다. 염색에 사용되는 대부분의 염료가 양전하를 가지고 있는데 세포의 표면은 음전하를 띄는 경향이 있기 때문에 이러한 염료들이 음전하를 띄는 경향이 있기 때문에 이러한 염료들이 세포 표면의 구조물들과 높은 친화력으로 결합하여 염색이 되는 것이다.

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실험 방법

1. 단 염색(Simple staining)

1) 슬라이드 글라스를 깨끗이 닦아 불꽃에 두세번 통과시킨 후 실험대 위에 놓는다.

 

2) 슬라이드 글라스 뒤쪽에 글라스 펜으로 세균을 도말 할 부분을 표시한다.

 

3) 백금이를 연필 잡는 식으로 잡고 불꽃 속으로 60° 각도로 넣어 백금선 부분이 전부 빨갛게 될 때까지 가열 후 시험관 속에 들어갈 백금이 대부분을 불꽃 속으로 2～3회 통과 시킨다.

 

4) 왼손으로 균이 들어 있는 시험관을 잡고 시험관의 뚜껑을 백금이를 잡은 바른손의 새끼손가락과 무명지 및 손바닥 아래 부분 사이에 고정하여 뺀 후 시험관 입구를 불꽃에 살짝 구운 다음 백금이를 시험관에 넣어 균액을 떠낸다. 다시 시험관 입구를 굽고 뚜껑을 막는다.

 

5) 도말(smear) : 백금이로 떠낸 균액을 슬라이드 글라스 표면에 가능한 한 얇게 넓게 바른다. 백금이는 다시 불꽃에 구워 실험대 위에 놓는다. (고체 배지의 균주는 슬라이드 글라스 위에 물을 한 방울 떨어뜨린 후 도말하였다.)

 

6) 건조(drying) : 도말표본을 공기 중에 말린다. (실험시에는 헤어 드라이로 건조)

 

7) 고정(fixation) : 말린 도말표본을 도말면 아래로 하여 불꽃 위에 두세번 통과시킨다. 이는 세균을 죽일 뿐만 아니라 세균의 단백을 응고시켜 슬라이드에 미생물을 고정시킨다.

 

8) 염색(staining) : 고정시킨 도말표본을 공기 중에서 식힌 후(화염통과로 뜨거워진 슬라이드)염색으로 표본위로 떨어뜨리고 약 30초～60초 동안 염색한다.

 

9) 수세(washing) : 염색액을 버리고 도말면을 아래로 하여 약하게 흐르는 수돗물로 천천히 조심스럽게 염색액을 씻어낸다. 이때 물이 직점 도말면에 닿지 않도록 주의한다.

 

10) 건조여지(blotting paper) : 도말표본 위의 물기를 제거한다. (여지를 슬라이드 위에서 비벼서는 안된다.)

 

11) 검경(microscopic observation) : 염색한 도말표본 위에 immersion oil 한 방울을 떨어뜨린 후 유침 대물렌즈로 표본을 관찰한다.

 

2. 그람 염색법(Gram Stain)

1) 슬라이드 글라스에 액체 배양된 세균액을 떨어뜨린 다음 넓게 펴서 알코올 램프를 이용하여 건조한다. 평판 배양한 세균은 슬라이드 글라스에 증류수를 조금 떨어뜨린 다음 균체를 고루 분산시켜서 고정시킨다. 지나치게 건조하거나 태우는 것을 조심한다. 건조가 충분하지 않으면 고정이 잘 되지 않는다. 세균을 고정한 면을 표시한다.

 

2) crystal violet 용액을 한방울 떨어뜨려 세균을 염색한다. (그람 양성, 그람 음성 모두 자주색으로 염색된다.)

 

3) 정확히 1분 후에 물로 세척한다. 시간을 정확히 지킨다. 수돗물을 약하게 틀어 간접 세척한다. (뒷면에 수돗물이 흐르게 하여 세척한다.)

 

4) 요오드 용액을 떨어뜨리고 1분간 매염시킨다. (염색된 세균에 요오드 용액을 처리하면 크리스탈 바이올렛과 요오드가 반응하여 세포내에 불용성의 복합체(크리스탈 바이올렛-요오드 복합체, CV-Ⅰ)을 형성한다. 따라서 그람 양성 및 음성 세균 모두 자주색으로 여전히 보인다.)

 

5) 수돗물로 간접 세척한다. (균이 다 씻기지 않을 정도로 세척한다.)

 

6) 알코올 용액으로 탈색한다. 약 30초 동안 실시한다. 그람 양성 세균인 경우, 자주색이 용해되어 나오는 것을 관찰할 수 있다. (착색된 세균에 탈색제인 알코올 시약을 처리하면 착색된 CV-Ⅰ 복합물이 용해된다. 이 때 그람 양성균과 음성균은 서로 다른 반응을 보인다. 그람 양성균인 경우에는 복합물이 세포내에 그대로 남아있지만, 그람 음성균은 탈색된다. 따라서 탈색 단계가 지나면 그람 양성균은 자주색이지만 그람 음성균은 백색으로 보인다.)

 

7) 수돗물로 세척한다.

 

8) safranin 액으로 1분간 염색한다. 그람 음성균은 분홍색으로 염색된다. (분홍색의 염기성 색소인 사프라닌(safranin)으로 대비 염색을 하면 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 사프라닌의 색인 분홍색으로 염색된다. 그러나 자주색으로 염색된 그람 양성균은 영향을 받지 않고 그대로 자주색으로 보인다.)

 

9) 물기를 제거하고 현미경으로 세포의 형태와 염색 상태를 관찰한다.

 

 

 

[미생물학실험]단 염색 (Simple staining)과 그람 염색 (Gram Stain) 레포트