생화학실험 | Digestion, Extraction and Ligation of DNA

 

 

 

TIP

 

 

제한효소와 플라스미드에 대해 알아보고 DNA 재조합 과정을 이해한다.

 

 

 

유전정보를 가지는 거대분자인 DNA 분자, 즉 유전자를 인간의 손으로 시험관내에서 자유로이 절단하거나 붙여 어떤 생물의 염색체 중에 삽입하여 목적으로 하는 특정의 유전자를 증식시키고 발현시키는 것이 가능해 졌다. 이와 같이 유전자를 인위적으로 조작하여 어떤 생물의 유전자에 다른 생물의 유전자를 삽입하고 그 유전자를 단일 clone으로 증식시키거나 발현시키는 것을 DNA 재조합 또는 유전자 조작이라고 한다.

 

유전자 재조합 기술은 생물학의 연구에 있어 가장 기본이 되는 것으로, 원하는 유전자 만을 증폭하거나, 특정 유전자를 다른 유전자와 재조합 시킬 수 있으므로 그 유전자의 역할 구명에 큰 이바지를 하고 있다. 그런 유전자의 역할은 그 산물인 단백질에 의해 이루어 진다. 다시 말해, 세포 내에 있어 단백질은 유전정보(genetic information)에 대한 직접적인 산물이며, 유전자(gene)는 단백질의 아미노산(amino acid)의 배열 정보를 갖고 있다.

 

단백질은 생체에 있어서 기능을 담당하고 있는 분자로서, 모든 생명에서의 필요한 과정과 화학반응을 담당하고 있다. 세포 내에 있어 단백질들의 상호 연구는 정상 세포와 암세포의 비교 분석을 통하여 그 질병 기전을 알 수 있게 될 뿐만 아니라, 생명의 본질을 이해하는 기초가 되는 연구를 제공한다. 단백질의 기능은 그 아미노산 배열이 입체 구조를 형성함에 따라 결정되는데, 구조를 이해하면 유전자의 조작기술을 통한 아미노산 배열의 변화에 의한 새로운 기능성 단백질을 제조 할 수 있게 된다.

 

단백질들의 연구의 기본에는 먼저 우리가 원하는 단백질 혹은 유전적으로 재조합 된 단백질을 대량으로 추출하여 실험의 재료로서 만드는 것이 필수적이다. 지금까지 많은 연구실에서 사용되고 있는 방식은 원하는 단백질의 아미노산의 배열 정보를 가지고 있는 유전자를 목적에 맞는 특정 벡터(vector: 유전자 운반체)에 삽입시켜, 대장균 혹은 효모 등의 미생물에 주입시켜 발현되게끔 하여 얻는 방법이다. 이러한 방법의 장점은 원하는 단백질 확보에 있어서 가격적인 면과 시간적인 면에서 크게 절감할 수 있다는 것이다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) Digestion

① TDW 3㎕, Vector 13㎕, 10X K Buffer 2㎕, BamH I 1㎕, Hind III 1㎕

② Heating Block에서 2～3시간동안 37℃로 처리

③ DNA Gel Electrophoresis (첫 번째 실험 방법 참조)

 

2) Power Gel Extraction Kit Protocol(agarose gel로부터 DNA 정제)

① agarose gel에서 DNA 조각을 자른다. 깨끗한 1.5㎖ microcentrifuge tube에다가 gel slice를 놓는다.

② gel slice 100mg 당 Power Gel Extraction buffer 600㎕를 넣는다.

③ 50～55℃에서 5～10분간 incubation 한다. gel slice가 완전히 녹을 때까지 2분마다 2～3번씩 tube를 뒤집는다.

④ collection tube에다가 spin column을 삽입한다.

⑤ 실온에서 column 과 centrifuge에 혼합물을 1분간 적용한다.

⑥ 상층액은 버리고 collection tube에 cloumn을 다시 삽입한다.

⑦ column과 centrifuge(2번)에 1분간 wash buffer 750㎕를 넣는다.

⑧ ⑥번 과정을 반복한다. 남은 wash buffer을 완전히 제거하기 위해 최고 13000rpm 이상의 속력으로 1분간 centrifuge 한다.

⑨ 깨끗한 1.5㎖ microcentrifuge tube에 spin column을 놓는다.

⑩ spin column membrane 중앙에다가 Elution buffer 이나 증류수 20～50㎕ 넣는다. 1분 후에 최고속력으로 1분 동안 centrifuge한다.

 

3) Ligation

① TDW 0.8㎕, Cdc25B 7㎕, KG 1㎕, Ligation buffer 1㎕, DNA ligase 0.2㎕

② 16℃ 에서 2시간동안 incubation한다.

③ 영하 20℃에 저장한다.

 

 

 

[생화학실험]Digestion, Extraction and Ligation of DNA 레포트