유전학실험 | 혈액을 통해 유전자 검사하는 과정

채혈

1. 소독을 위해 70% isopropyl alcohol이 권장되며 채혈할 부위를 중심으로 바깥쪽으로 원형을 그리듯이 닦아낸다. 소독약이 마르지 않았을 때 채혈을 하면 용혈이 발생하므로 소독약이 완전히 마른 후에 채혈을 실시한다.

2. 압박대는 소독약이 마른 후 채혈 직전에 사용하거나, 묶은 상태로 1분 이상 방치해서는 안된다.

3. 채혈은 바늘 굵기가 18-23G인 주사기를 사용하거나 상품화된 진공채혈관과 일회용 채혈바늘을 사용하여 실시한다.

4. 주사기를 사용하여 채혈할 때는 주사바늘의 사면이 위로 향하게 하여 채혈하고자 하는 정맥에 찌른다.

5. 정맥내에 주사바늘이 들어갔음을 확인하고 지혈대를 푼 후에 혈액을 채취한다. 이때 혈액채취를 빨리하면 피가 잘 나오지 않거나 적혈구가 용혈되는 경우가 있으므로 천천히 채혈한다.

6. 채혈이 끝난 후에는 거즈를 채혈부위에 대고 주사바늘을 정맥에서 빼고, 거즈로 채혈부위를 눌러 지혈시킨다.

7. 채혈용기에 혈액을 채운다.

 

 

gDNA 분리

Genomic DNA를 추출하는 프로토콜은 크게 두 가지 부분으로 나눌 수 있다. 첫째 세포조직을 조심스럽게 분해(Lysis)한 후, DNA를 적절히 용해시키는 기법과 둘째, 몇 가지 기본적인 효소나 화학적인 처리기법을 통하여 단백질, RNA 또는 기타 고분자 화합물을 제거하는 과정을 거치게 된다.

 

 

 

실험 방법

1. Isolation DNA from Blood

1) blood를(약 300㎕) 37℃에 약 1-2분간 충분히 녹인다.

2) 2X BBC lysis buffer 900㎕ 첨가(blood의 약 3배 volume)

3) vortexing 20s

4) ice or RT 10min

5) 13000rpm 1min centrifuge

6) 상충액 제거

7) 만약에 pellet이 붉다면 2-6회 반복하여 시행한다. (RBC를 완전히 깨서 제거 후 다음 step으로 넘어가는 것이 좋다.)

8) cell lysis solution 300㎕ 37℃ 30min-1hr 후 pipetting

9) PPT 100㎕

10) 20s vortex

11) ice 5min

12) 1300rpm 3min centrifuge

13) 상층액만 다른 tube에 취한다.

14) Isopropanol 300㎕(sample : isopropanol = 1:1)

15) imverting(DNA가 엉기는 것이 보일 때까지)

16) 13000 rpm 1min centrifuge

17) 상층액만 버린다.

18) 13000 rpm 1min centrifuge

19) 상층액 버린다.(pellet 날아가지 않게 조심한다.)

20) pellet dry

21) TE 첨가(10-30㎕ pellet 크기에 따라 다름)

22) nano drop 측정(농도확인 260/280, 260/230 ratio 확인, 1.8 2.0 이상 권장)

23) 1% agarose gel loading(밴드 확인)

 

2. 1% Agarose gel 만들기(30㎖)

1) 0.3g agarose 와 30㎖ TBE 섞는다.

2) stirrer/hot plate에서 녹인다. (바글바글 끓어 빛에 비춰봤을 때 보이는 입자가 없을 때까지)

3) gel tray 조립

4) 녹인 용액에 EtBr(5㎕/100㎕) 넣고 섞는다.

5) 용액을 gel tray에 붓고 bubble 유무확인하고 터뜨린다.

6) comb 끼우고 굳힌다.

7) 쓰레기는 옆의 조그만 실험용 쓰레기 통에 버린다.

8) 쓴 비커등은 바로 설거지

 

3. 전기영동

1) 검은색 전선은 -, 빨간색 전선은 +이므로 gel wall이 검은쪽을 향하게 놓는다.

2) sample 순서 확인하고 parafilm위에서 loading dye 섞은 후 gel에 loading

3) 100V에 맞추고 run을 누른다.

4) marker 아래 band가 gel 의 반정도 내려오면 gel 사진을 찍는다. 10V/㎝(㎝는 백금선 사이의 거리)

 

4. gel 사진찍기

1) power on

2) UV on

3) Live 눌러 화면에 gel이 보이면 밝기, 크기, focus 맞춘다.

4) freeze 누른다.

5) save 누른다.

6) memory card 가져와서 컴퓨터로 옮긴다.

 

5. Multiplex PCR

1) DDW 9.7㎕, DMSO 1.8㎕, polymerase 0.5㎕, dNTP 2㎕, sample 1㎕, primer3개(forward, reverse) 각각 0.5㎕, PCR buffer 2㎕를 넣는다. 여기 들어가는 polymerase는 상온에서도 반응이 일어나는 것이기 때문에 ice에서 넣어준다.

2) PCR 기계 설정을 한다. 95℃ 2분 hold, 95℃ 30초+ 58℃ 30초+ 72℃ 30초 30cycle, 72℃ 5분

 

 

 

[유전학실험]혈액을 통해 유전자 검사하는 과정 레포트