일반생물학실험 | Observe the mitotic chromosome of animal cells

 

 

 

TIP

 

 

두 가지 방법을 통해 동물세포의 유사분열 염색체를 관찰할 수 있다.

 

 

 

유사분열이란, 유전체 양의 변화가 없는 세포분열이며 이 과정에서 방추사가 생기고 염색체가 나타나는 핵분열의 한 형식으로 간접분열이라고도 한다. 유사분열은 전기, 중기, 후기, 말기로 이루어진다. 유사분열이 일어나기 전 간기에는 느슨한 형태의 풀어진 염색체가 존재한다. 전기는 초기와 후기로 나뉘는데 전기의 초기에는 핵이 4개의 염색체를 가지고 있는 모습이며 염색체는 2가닥으로 갈라진 모습을 하고 있는데 한 가닥을 염색분체라고 한다. 전기의 후기에는 각각의 염색체가 염색분체를 2개씩 복제하며 방추체의 구조가 만들어지며 전기과정에서 핵막이 파괴되며 느슨한 염색체의 응축이 일어난다.

 

중기과정에서는 염색체들이 방추체의 중심을 따라 줄지어 늘어서며 염색체를 이루고 있는 각각의 염색분체는 서로 다른 극으로부터 유래하는 방추사와 결합하게 된다. 후기의 과정에서는 각각의 염색분체 사이의 결합이 방추사에 의해서 끊어지게 되고, 끊어진 각각의 염색분체가 각 말단으로의 이동이 이루어진다. 말기에는 응축되어있던 염색체가 다시 풀리며 이들 주변으로 다시 핵막이 형성된다. 핵이 분열한 후 나머지 세포들도 분열하게 되고 2개의 동일한 딸세포가 만들어지게 되며 딸세포는 동일한 염색체 수를 가지게 된다. 또한 유사분열은 모세포와 딸세포의 염색체 수에 따라 체세포분열과 감수분열로 나뉘게 된다.

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실험 방법

1. Preparation of Mouse Metaphase Chromosomes

1) 배양된 B16F10의 media에 colchicine(10㎎/㎖)을 4μg/㎖이 되도록 첨가한다. ⇒ (Total medium 10㎖에 4㎕)

 

2) 2시간 동안 37℃ incubator에서 배양한다.

 

3) Media를 제거하고 1X PBS 5㎖로 washing한 후 0.5% Trypsin-EDTA를 1㎖ 처리한다.

 

4) 3～5분 간 37℃에 둔 후 media(+FBS) 4㎖을 넣고 pipetting하여 cell을 50㎖ conical tube로 옮겨준다.

 

5) 상온의800rpm에서 3분간 원심 분리한다.

 

6) Media을 제거하되 500㎕ 정도의 medium을 남긴다. 남긴 media로 pellet을 pipetting하여 풀어준다.

 

7) 1 ㎖의 0.075M KCl을 pipet을 이용해 한 방울씩 천천히 넣어준다.

 

8) 4 ㎖ 0.075M KCl을 더 넣어준 후 (Total 5㎖) inverting하여 잘 섞어 준다.

 

9) 37℃ incubator에서 15분 둔 후, 상온의800rpm에서 3분간 원심 분리한다.

 

10) 500 ㎕ 정도의 KCl 용액을 남기고 제거 한 뒤, pipetting하여 pellet을 풀어준다.

 

11) 1㎖의 고정용액(methanol 3 : acetic acid 1)을 pipet을 이용하여 한 방울씩 천천히 넣어준다.

 

12) 4㎖의 고정용액을 더 넣어준 후 inverting하여 섞어 준 뒤, 10분 간 상온에 둔다.

 

13) 상온의 800rpm에서 3분 간 원심 분리한다.

 

14) 10번 과정과 동일하게 실시한다.

 

15) 5㎖의 고정용액을 넣고 inverting한 후 상온의 800rpm에서 3분 간 원심분리한다.

 

16) pellet 이외의 용액을 제거한다. (pellet이 쉽게 풀리기 때문에 집중력을 요함)

 

17) 1㎖의 고정용액으로 pellet을 잘 풀어준다.

 

2. Spreading & Staining of Mouse Metaphase Chromosomes

1) 슬라이드 글라스를 45°로 기울여 준비한다.

 

2) 준비한 세포현탁액을 슬라이드 글라스로부터 위로 약 15～30㎝ 떨어진 지점에서 떨어뜨린다. ⇒ (슬라이드 글라스의 한 지점을 정하여 8방울～10방울 정도 떨어뜨린다. 단, 위쪽을목표로하여현탁액이아래로흐를수있도록떨어뜨려준다.)

 

3) 슬라이드 글라스를 5～10분간 말린 후 Giemsa 용액에 10분 간 staining한다.⇒ ( + DAPI staining = DAPI 염색 후 cover glass를 덮고 TDW로 washing > 형광 현미경으로 관찰)

 

4) TDW에 5분 destaining한다.

 

5) 커버글라스를 덮은 뒤 현미경 배율을400x에서 1000x로 높이면서 염색체를 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]Observe the mitotic chromosome of animal cells 레포트