대장균(Escherichia coli, E. coli)로 부터의 플라스미드 DNA(Plasmid DNA)분리는 연구실험에서 많이 알려져 있다. Mini-prep이라 불리는 Alkaline lysis method을 이용하여 Plasmid DNA을 빠르고 쉽게 추출하자.
plasmid DNA 분리 방법
plasmid DNA분리는 주로 miniprep이라고 부르는 방법으로 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면 된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다.
이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.
bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만 성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면 Alkaline lysis prep, boiling method ,lithium-based procedure 이다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) 배양액 5㎖를 원심분리를 이용하여 대장균을 침전시켜 얻는다.(이러한 과정을 pellet이라 하는데 배양액을 1㎖씩 분취하여 원심분리 후 상등액을 버리고 다시 1㎖를 분취하여 원심분리 후 다시 상등액만 버리는 과정을 배양액 5㎖ 모두를 실행하여 대장균을 얻는다. 이때 한꺼번에 5㎖를 원심분리 하여도 되지만, 실험의 정확성을 위해 여러번 나누어 원심분리 한다.)
2) buffer Sol 1을 250㎕를 첨가하고 pipetting 한다.
3) buffer Sol 2를 250㎕를 첨가하여 아래위로 흔들어 섞어준다.
4) buffer Sol 3를 350㎕ 첨가하여 다시 아래위로 흔들어 섞어준다.
5) 10분 동안 원심분리 한다.
6) 상등액을 분리하여 spin column으로 옮기고 1분 동안 원심분리 한다.
7) Washing buffer(100% EtOH(에탄올))를 300㎕를 첨가하여 1분초 동안 원심분리 한다.
8) 혹시나 남아있을 에탄올을 완전히 날리기 위해서 1분 동안 한번 더 원심분리를 한다.
9) Elution buffer를 50㎕ 첨가하여 1분 동안 원심분리 한다.
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