생명공학실험 | Plasmid DNA preparation

 

 

 

TIP

 

 

Ampicillin에 대하여 저항성을 지닌 E. coli (XLI-Blue, Amp-r) 의 plasmid DNA pBluescript SKⅡ(+)를 isolation 한다.

 

 

 

Plasmid DNA를 정제하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용되는데 공통적으로 다음의 세 과정- 미생물의 배양과 플라스미드 증폭 ; 미생물 수거와 cell lysis ; plasmid DNA 정제-을 거친다.

 

DNA를 분리하기 위해서는 일단 DNA가 세포 밖으로 유출되도록 세포벽 및 세포막을 분해 시켜야 하고, 이때 DNA 가수분해 효소들의 활성을 억제하는 조건에서 DNA를 분리해야 하며 단백질이나 RNA가 같이 회수되지 않도록 해야 한다.

 

세포벽을 가지는 박테리아의 경우에는 먼저 lysozyme을 처리하여 세포벽을 분해 시키며 세포막은 detergent인 SDS를 처리함으로써 분해 시킨다. SDS는 세포막을 분해 시킬 뿐만 아니라 단백질을 변성시킬 수 있어 핵산 가수분해효소들의 작용을 억제할 수 있다. 단백질들은 phenol과 chloroform을 처리함으로써 제거할 수 있다. DNA는 alcohol에 의한 침전으로 얻을 수 있다. RNA는 RNase에 의해 가수분해 되어 제거되고 최종적으로 순수한 DNA를 얻을 수 있다.

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실험 방법

1. by Alkaline lysis Method

1) 10 ㎖ LB Broth(containing ampicillin)가 들어있는 Cap tube에 균주를 접종하고, 37℃, 150 ～ 180 rpm으로 setting된 shaking incubator에 넣고 배양시킨다.

 

2) Spectrophotometer로 600nm에서 O.D.값을 측정하여 0.3～0.4일 때, 배양액을 1.5 ㎖ sampling하여 eppendorf tube에 옮기고 남는 것은 4℃ chamber에 보관한다.

 

3) 균주를 10 min동안 12,000 rpm으로 원심 분리시킨 뒤, pipette로 상등액을 제거한다.

 

4) 위 과정에서 얻은 bacterial pellet에 300 ㎕ ice-cold SolutionⅠ을 첨가하고 voltexing or pipetting시킴으로써 resuspension 시킨다.

 

5) Solution Ⅱ를 300 ㎕ 첨가한다. Eppendorf tube를 닫고, 10 sec동안 위아래를 반복 하 여 뒤집는다. (절대로 voltexing 하면 안 된다.) 그리고 eppendorf tube를 얼음에 5 min 동안 보관한다.

① lysozyme : egg white, tears, saliva에 존재하는 효소로 bacterial cell wall을 구성하는 중합체인 peptidoglycan의 β(1,4) glycosidic bond를 절단

② EDTA(EthyleneDiamineTetraAcetate) : cell wall의 전체구조를 유지시키는데 필수적인 Mg 이온을 제거하여 cell wall을 불안정화시킴, DNA분해효소 불활성화시킴.

③ SDS(Sodium Dodecyl Sulphate) : 세포막의 지질분자 제거

 

6) Ice-cold Solution Ⅲ 300 ㎕를 첨가한다. Eppendorf tube를 닫고, 10sec 동안 위아래 를 반복하여 뒤집음으로써 재 현탁 시킨다.

 

7) 4℃의 microcentrifuge 안에서 10 min, 12,000 rpm에서 원심분리를 한 다음, 상등액을 위하여 새로운 eppendorf tube로 옮긴다.

 

8) 위에서 취한 sampling양과 동량의 Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol을 첨가한다. 그리고 강하게 voltexing한다. 역시 4℃의 microcentrifuge안에서 5 min, 12,000 rpm 에서 원심분리를 한 다음, 상등액을 취해서 새로운 eppendorf tube로 옮긴다.

 

9) Ice-cold 100% Ethanol 2 volumes를 첨가하고, inverting 한 다음 냉동고에서 20 min 보관하면서, plasmid DNA를 침전시킨 후, 4℃의 microcentrifuge안에서 10 min, 12,000 rpm에서 원심분리 시킨다. 살며시 따라버리고 입구에 있는 ethanol을 제거한다.

 

10) 4℃에서 70% Ethanol 700 ㎕로 plasmid DNA 의 pellet을 헹군 후, 위에서 행한 방법 으로 상등 액을 제거한다. 그리고 Nucleic acid (plasmid DNA)가 들어있는 pellet을 10 min 동안 다 마를 때 가지 공기 중에서 말린다.

 

11) TE buffer solution 50 ㎕를 첨가하여, Nucleic acid(plasmid DNA)를 재 용해시키고, 간단히 voltexing 한 후, -20℃ freezer에 보관한다. 확인은 gel electrophoresis 한다.

 

 

[생명공학실험]Plasmid DNA preparation 레포트