미생물생리학실험 | Plasmid Vector 추출

 

 

 

TIP

 

 

다양한 vector의 종류 및 쓰임, 추출방법을 익히고, plasmid 추출 kit를 이용하여 직접 plasmid를 추출해본다.

 

 

 

Alkaline Lysis 원리

높은 pH의 Alkaline 용액 상태에서 염색체 DNA와 plasmid DNA의 크기 및 topology에 의해 염색체 DNA와 혼합된 상태로부터 plasmid DNA만 분리한다. Alkaline 상태의 Anionic detergent 용액에서 detergent에 의해 세포가 용해된 후 염색체 DNA 와 plasmid DNA 모두 Alkaline 용액에 노출되면 두 형태의 DNA는 모두 변성된다. 이후 산성용액을 혼합하면 염색체 DNA는 크기가 너무 커서 변성 전 정상적인 Topology로 복원되지 못하고 더욱 엉기는 반면 Plasmid DNA는 크기가 작기 때문에 정상적으로 복원된다. 이때 원심분리를 이용해 엉긴 염색체 DNA는 세포 찌꺼기 및 변성된 단백질과 함께 침전물로 갈아앉고 plasmid DNA는 용액에 녹아 염색체 DNA와 구분되어 분리된다. 용액에 녹아 있는 plasmid DNA는 “silica막을 통한 흡착 후 용출법“에 의해 순수하게 회수하여 얻는다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) T-Blunt vector가 들어있는 균을 LB broth 5㎕, Amp 5uㅣ을 섞은 배지에 주입하고 shaking incubator에서 12시간 이상 37℃인 조건에서 배양한다.

 

2) centrifuge 3000rpm으로 10분 진행한다.

 

3) solution Ⅰ 250㎕ 넣어주고 pipetting한 뒤 e-tube에 넣는다.

 

4) solution Ⅱ 250㎕ 넣어주고 inverting 10회 진행해준다.

 

5) solution Ⅲ 350㎕ 넣어주고 inverting 10회 진행해준다.

 

6) ice에서 5분 간 반응한다.

 

7) centrifuge 13,000rpm 4℃에서 10분간 진행하고 상층액을 column에 옮겨준다.

 

8) Table centrifuge 10초 진행한다.

 

9) Washing Buffer 700㎕ 넣어주고 Table centrifuge 10초 진행한다.

 

10) 공회전 Centrifuge 13,000rpm 4℃ 5분간 진행한다.

 

11) 37℃로 15분 동안 dry 시켜준다.

 

12) D.W 50㎕ 넣어주고 centrifuge 13,000 rpm 4℃에서 5분동안 진행한다.

 

13) 전기영동한다.

 

 

 

[미생물생리학실험]Plasmid Vector 추출 레포트