일반생물학실험 | 플라스미드 DNA 추출

 

 

 

TIP

 

 

Alkaline lysis (denaturation) method에 대해 알아보고 이 방법을 통해 플라스미드 DNA를 추출해본다.

 

 

 

DNA Mini prep이란 말을 쓰는데 prep은 ‘prepartion’의 줄임말로 DNA를 소량으로 추출한다는 의미이다. plasmid를 추출하는 방법으로는 기본적으로 여러가지가 있지만 그 가운데 대표적인 방법으로 alkaline lysis (denaturation) method가 이용되고 있다. 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix를 형태를 가지는 반면 plasmid는 동그란 모양인 supercoiled형태를 가짐으로써 pH의 변화에 따라서도 plasmid의 형태 와 구조가 크게 변하지 않는다는 특징을 가지고 있다.

 

plasmid는 주로 vector로 많이 사용되는데 이 vector란 원하는 유전자 단편을 숙주세포 안으로 안정하게 운반하는 vehicle 형태 즉 운반체의 역할을 하는 것을 말한다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자 뿐 아니라 항생제 합성이나 독 물질 합성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀지고 난 후 분자유전학연구에 많이 쓰이게 되었다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 액체 LB배지 대장균 Amp 넣고 배양후 1㎖취해 튜브에 넣고 12000rpm에서 1분간 돌림

 

2) 상층액 버리고 1㎖ 대장균 넣은 후 12000rpm에서 1분간 돌려준다.

 

3) 상층액 제거 후 Sol I 버퍼 100㎕ 넣은 후 ice에 30분간 보관한다.

 

4) Sol II 200㎕넣고 5분 ice에 보관 후 Sol III 150㎕넣고 ice에 30분 보관 후 13000rpm에서 5분 돌려준다.

 

5) 400㎕ 정도(200씩 2번) 상층액만 취해서 새 튜브에 넣은 후 같은 양의 phenol: chloroform (1:1)을 넣어준다.

 

6) 12000rpm에서 5분 돌려준 후 위에 있는 상층액 300㎕취해 새 튜브에 넣고 100% 에탄올 600㎕넣음 이때 상층액만 반드시 취해야함

 

7) 20분 동안 -70°C에서 보관 후 12000rpm에서 5분 돌림

 

8) 용액을 다 쏟아버린 후 70% 에탄올 500㎕ 넣고 12000rpm에서 5분 돌린 후 에탄올 버리고 12000rpm에서 다시 1분 돌린다.

 

9) 파이펫으로 에탄올만 제거한 후 에탄올이 마를 때까지 10분정도 말린다.

 

10) DW넣고 RNase 넣은 후 ice에 30분 보관 후 4°C에 보관한다.

 

 

 

[일반생물학실험]플라스미드 DNA 추출 레포트