일반생물학실험 | 플라스미드 추출

 

 

 

TIP

 

 

Mini-prep라 불리는 Alkaline lysis method을 이용하여 Plasmid DNA을 추출한다.

 

 

 

Alkaline lysis

Alkaline lysis의 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrance을 부수고 DNA만을 분리하는 것이다. 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리해야 한다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.

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실험 방법

1. Spin Down Bacterial cells

1) Harvesting

① 1.5㎖의 bacteria culture를 microcentrifuge tube에 옮겨담는다.

② 1분간 full speed(13,000rpm)로 centrifuge한 후 위에 뜨는 액체를 버린다.

 

2) Resuspension

① 200㎕ of PD1 Buffer(RNase A 첨가된 것)을 200㎕ 넣는다. 그 후 cell pellet를 votex하여 resuspend하게 한다.

 

2. Cell Lysis.

1) Lysis

① 200㎕의 PD2 Buffer를 첨가하고 tube를 10번 위아래로 (천천히 부드럽게) dddddd섞는다. Vortex하지 않는다.(genomic DNA가 망가지는 것을 방지)

② 맑아질 때까지 혼합물을 상온에서 2분 놔둔다.

 

3. Spin.

1) Neutralization

① 300㎕의 PD3 Buffer를 첨가하고 바로 천천히 부드럽게 10번을 위아래로 섞는다. Vortex 하지 않는다.

② 2분간 full speed(13,000rpm)로 Centrifuge한다.

 

4. DNA Binding.

1) DNA Binding

① Column을 2㎖ Collection tube에 끼운다.

② 맑은 상충액을 400㎕ PD column에 넣는다.

③ 30초간 full speed(13,000rpm)로 Centrifuge한다.

④ 통과한 액체를 버리고 PD Column을 2㎖ Collection tube에 다시 끼운다.

 

5. Wash Step.

1) Wash

① 400㎕의 W1 Buffer을 Column에 넣는다.

② 30초간 full speed(13,000rpm)로 Centrifuge한다.

③ 통과한 액체를 버리고 PD Column을 2㎖ Collection tube에 다시 끼운다.

④ 600㎕의 Wash Buffer(ethnal 첨가된 것)를 column에 첨가한다.

⑤ 통과한 액체를 버리고 PD Column을 2㎖ Collection tube에 다시 끼운다.

⑥ 3분간 full speed로 centrifuge하여 column matrix를 말린다.

 

6. Elution Step.

1) DNA Elution

① 마른 PD column을 깨끗한 1.5㎖ microcentrifuge tube에 옮긴다.

② 50㎕의 buffer가 column의 벽에 들러붙지않도록 한다.

③ 액체가 흡수될 때까지 2분간 기다린다.

④ 2분간 full speed(13,000rpm)로 Centrifuge한다.(plasmid DNA를 녹여서 분리시킴)

 

 

 

[일반생물학실험]플라스미드 추출 레포트