생화학실험 | Polyacrylamide Gel Electrophoresis

 

 

 

TIP

 

 

폴리아크릴아미드 젤 영동법에 대해 알고, 만드는 방법을 익힌 후 PCR을 통하여 밴드를 비교해본다.

 

 

 

PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 Acrylamide와 bis-acrylamide를 중합시켜서 형성된 gel을 이용하여 전기영동을 하는 것으로, 단백질 입자가 acrylamide의 공극 사이를 지나가게 됨으로써 입자가 큰 것은 진행속도가 더디고, 입자가 작은 것은 진행 속도가 빠르게 되며, 같은 크기의 이바이면 하전량이 많은 것이 더 빨리 이동하게 되는 원리를 이용하여 일정시간 동안 움직인 거리에 의해 단백질 종류를 구분하는 방법이다. SDC 등을 사용하지 않으므로 nondenaturing gel electrophoresis 또는 native gel electrophoresis 라고도 하며, 효소 등과 같이 분석 중에 변성되며 안되는 종류를 분석할 때 많이 이용된다. 실험 중에 단백질의 변성을 막기 위해, 추출이나 전기 영동 작업은 0～4℃ 정도에서 하는 것이 좋다.

 

PAGE에 의해 전개되는 정도는 gel의 농도와 buffer의 P.H 전압 등에 따라 차이가 있다. gel의 농도는 높아질수록 공극의 크기가 작아지므로 분자량이 적은 것을 분석할 경우에는 gel의 농도를 높이고, 분자량이 큰 것을 분석할 경우에는 반대로 gel의 농도를 낮춘다. gel의 농도는 4～25% 정도를 이용하는데, 7～15% 정도의 농도가 가장 많이 이용된다. 그리고 acrylamide와 bis-acrylamide의 비율에 따라서도, 전개정도에 차이가 난다.

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실험 방법

1. PCR loading

1) PCR이 끝난 sample과 파라필렌을 준비한다.

 

2) 6X dye 3㎕와 PCR sample 10λ를 넣어 섞은 후, 준비되어 있던 아 가로스겔의 well에 loading한다.

 

3) 100V의 전압을 걸어, 충분한 시간이 흐른 후 확인한다.

 

2. 폴리아크릴아미드 겔 만들기

1) 50㎖ 튜브에 30% 아크릴아미드 2㎖와 100% 글리세롤 700㎕, 2M의 Tris-Cl(pH8.8) 165㎕, 마지막으로 증류수 7.135㎖을 넣은 후 잘 섞어준다.

 

2) 폴리아크릴아미드 겔을 만들기 위해 유리판을 증류수로 세척하고 조립한 후, 만들어 놓은 용액을 유리판 면적의 70% 가량을 차지할 때 까지 파이펫 통해 부어준다.

 

3) 유리판의 남은 30% 부분은 밑의 겔이 섞이지 않도록 3차 증류수를 천천히 부은 후 겔이 굳을 때 까지 기다린다.

 

4) 겔이 굳은 후, 위의 증류수 부분은 paper를 통해 흡수시켜 제거한다.

 

5) 30% 아크릴아미드 500㎕, 100% 글리세롤 350㎕, 2M Tris-Cl 82.5㎕, 증류수 4067.5㎕를 넣어 혼합한 후, 증류가 제거된 부분에 붓고 comb을 천천히 낀다.

 

6) 겔이 굳으면, 겔이 망가지지 않도록 천천히 comb을 제거한다.

 

 

 

[생화학실험]Polyacrylamide Gel Electrophoresis 레포트