E.coli를 배양해 플라스미드를 분리하고, 분리한 플라스미드를 직접 만든 Agarose gel을 이용하여 전기 영동한다.
전기영동의 원리
DNA 젤 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라 분리하는 간단한 방법이다. 50V-100V 정도의 전류를 장치에 흘려보낸다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있으며 따라서 두 전극 사이에 위치해 있을 때 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 DNA 분자가 젤 매트릭스를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA보다 빠르게 움직이는 것으로 알려져 있다.
실험 방법
1. Plasmid 분리
1) plasmid pPP1를 가지는 E.cloli를 하룻밤 키운다,
2) 각 조당 1.5㎖ tube에 1) 균 현탁액을 1.5㎖ epp. tube에 1㎖을 넣어준다.
3) 최대속도에서 1분간 원심분리한 후 상등액을 따라 버리고 한 번 더 5초간 심분리하고 남아 있는 액체를 micropipette을 이용하여 최대한 제거한다.
4) tube에 100㎕ 용액1을 넣고 손가락으로 쳐서 pellet 상태의 세균을 녹인다.
5) 여기에 용액2를 200㎕ 넣고 10회 정도 뒤집어 부드럽게 섞는다. 세포가 NaOH, SDS에 의해 부서지고 단백질도 변성됨.
6) 5초간 원심 분리하여 뚜껑에 묻은 액을 밑으로 내려 보낸다.
7) 여기에 용액3을 150㎕ 넣고 10회 정도 뒤집어 부드럽게 섞는다. 과정은 용액을 중화하고 플라스미드 이외의 물질을 침전시키는 과정
8) 최대속도로 10분간 원심분리한다.
9) 상등액을 새 1.5㎖ epp. tube로 옮긴다 : 여기에 플라스미드가 들어있다.
10) 여기에 100% 에탄올 1㎖을 넣고 뒤집기를 10회 반복하여 잘 섞는다.
11) 냉동실에 20분간 보관한다.
12) 최대속도로 15분간 원심 분리한다.
13) 상등액을 버리고 다시 5초간 원심분리 한 후 남은 액체를 완전히 제거한다.
14) 70% 에탄올 1㎖을 넣고 부드럽게 tube 벽면을 적신다 : 남은 염을 제거
15) 최대속도로 5분간 원심 분리한다 : 침전한 것이 플라스미드
16) 상등액을 버리고 다시 5초간 원심분리 한 후 남은 액체를 완전히 제거한다.
17) 뚜껑을 열고 약 20초간 건조시킨다.
18) 50㎕ TE buffer를 넣고 플라스미드를 녹인다.
2. Agarose gel을 이용한 plasmid 전기영동
1) Agarose gel 만들기
① agarose을 0.4g의 무게를 측정하여 작은 삼각플라스크에 담는다.
② 1X TAE 40㎖를 agarose가 담긴 삼각플라스크에 넣는다.
③ 전자렌지에 1분 동안 삼각플라스크를 넣고 작동시킨다.
④ 따뜻한 정도가 될 때, 트레이에 붓는다.(gel에 기포가 생기지 않도록 조심한다.)
⑤ 완전히 굳으면 불투명한 색을 띤다.
2) 전기영동
① 전기영동 장치에 1X TAE를 넣고, 완전히 굳은 agarose gel을 담근다.
② 파라필름을 적당히 잘라 준비한다.
③ H2O 5㎕ + dye 3㎕ + plasmid 2㎕
④ H2O 5㎕ + dye 3㎕ + Lambda DNA/Hind III marker 1㎕를 잘 섞은 뒤 준비한 agarose gel의 well에 loading 한다.
⑤ 전기영동 장치를 작동시킨다.(100V) (-에서 +방향으로 전류가 흐르도록 한다.)
⑥ 전기영동이 마친 gel을 꺼내 EtBr에 10분간 담가둔다. (EtBr : DNA와 결합하여 UV를 쪼이면 형광을 발해서 눈에 보인다.)
⑦ 자외선 조사기로 확인 후 사진을 찍는다.
[일반생물학실험]Plasmid 분리 실험 & Agarose gel을 이용한 plasmid 전기영동 레포트
1. 실험 목적 1.1. E.coli를 배양해 플라스미드를 분리하고, 분리한 플라스미드를 직접 만든 Agarose gel을 이용하여 전기 영동한다. 2. 실험 배경 2.1. Plasmid DNA 분리의 원리 주로 mini-prep이라고 부르는
www.happycampus.com
댓글