화공생명공학기초실험 | 염색체 DNA의 정제 및 분석

 

 

 

TIP

 

 

박테리아로부터 염색체 DNA를 분리, 정제 하는 과정에서 각 시약과 Enzyme의 작용과 실험과정을 이해하고 PCR과 전기영동법에 대해 알아보며 장치의 조작 방법을 습득한다.

 

 

 

DNA는 생명체의 모든 유전정보를 가지고 있는 하나의 거대한 정보저장물질이다. 이러한 DNA를 분석하기 위해선 다량의 DNA를 확보하는 기술이 중요한데 1984년 Kery M㎕lis에 의해 PCR이라는 방법이 도입된 이래 원하는 부분만큼의 DNA부분을 증폭시킬 수 있는 기술이 확보 되었다. 본 실험에서는 DNA를 정제하여 PCR을 이용해 다량 증폭시키고 Agarose gel 전기영동법을 이용하여 DNA를 분석해본다.

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실험 방법

 1. 세포에서의 DNA추출

1) OD가 1.0이 조금 넘은 배양 세포를 마이크로 튜브에 넣고, 10분동안 7500rpm으로 원심분리한다. 상등액은 버린다.

 

2) ATL buffer를 180㎕ 넣은 후 희석시킨다.

 

3) 20㎕의 proteinase K를 추가하고, 볼텍싱하여 섞어준다. 55℃에서 3시간 배양하여 완전히 분해시킨다. 샘플이 분해되는 동안 종종 볼텍싱을 해준다. 또는 shaking용 water bath를 사용한다. (샘플은 젤라틴 같은 것이다. 너무 심하면 처음 시작 배양의 OD가 너무 심했던 것이다.)

 

4) 15초동안 볼텍싱한다. AL buffer 200㎕넣고, 즉각적으로 충분히 볼텍싱 해야한다. 그리고 10분이상 70℃에서 배양한다. (AL buffer 때문에 처음에 침전이 보이지만 배양하면서 녹을 것이다.

 

5) 200㎕ 에탄올을 추가한다. 그리고 충분히 볼텍싱한다.(하얀침전이 생길것임)

 

6) 2㎖ 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 꽂아둔다. 샘플을 피펫을 사용해 컬럼으로 옮긴다.

 

7) 8000rpm으로 1분간 원심분리.

 

8) 새로운 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 옮겨둔다. AW1 buffer 500㎕를 추가하고, 8000rpm으로 1분동안 원심분리한다.

 

9) 새로운 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 옮겨둔다. AW2 buffer를 500㎕추가하고, 14000rpm으로 3분간 원심분리한다.(또다른 콜렉션 튜브로 14000rpm으로 1분간 돌려서. 에탄올을 모두 없앤다.)

 

10) 깨끗한 1.5㎖ 마이크로튜브로 스핀컬럼을 옮긴다. 막의 바로위에 AE buffer 200㎕를 주입한다. 1분간 상온에 둔 후, 8000rpm으로 1분간 원심분리한다.

 

11) (막의 위에) 동일한 마이크로튜브로 9번 과정을 다시 한번 반복한다.

 

2. PCR

1) micro tube에 정량한 모든 시약을 넣고 뚜껑을 닫는다.

 

2) 시약이 잘 섞이도록 볼텍싱으로 잠시 Down시킨다.

 

3) PCR에 tuve를 위치시킨뒤 뚜껑을 닫는다.

 

4) 기계의 온도와 싸이클(25회)을 설정한다.

① 1단계- denaturation : 1분, 95℃

② 2단계- annealing : 1분, 55℃

③ 3단계- polymerization : 1분, 72℃

[단, 첫 번째 싸이클에서 1단계를 5분으로, 마지막 싸이클에서는 3단계를 5분으로 늘린다.]

 

3. agarose gel 전기영동 확인법

1) 삼각플라스크에 0.5×TAE buffer 100㎖에 agar 0.8g를 넣는다.

 

2) 시료를 간단히 흔들어 섞어준 후 랩으로 입구를 막고 전자랜지에 1분30초간 가열한다.

 

3) 꺼낸 플라스크를 미지근할 때까지 식힌 후 EtBr 5㎕를 가한다.(EtBr은 발암물질이므로 피부에 닿지않도록 주의한다.)

 

4) 시료를 holder에 붓고 15분간 식히며 굳게 한다.

 

5) 젤 형태로 굳은 것이 확인되면 holder를 전기영동기에 꽂는다.

 

6) 0.5×TAE buffer 500㎖ 을 전기영동기에 젤이 잠길정도로 찰랑찰랑하게 붓는다.

 

7) 젤의 첫 홈에 ladder 혼합용액 10㎕를 주입한다.

 

8) 젤의 나머지 홈에 PCR을 마친 DNA 40㎕와 loading dye 4.4㎕를 섞어서 젤의 나머지 홈에 10㎕를 주입한다.

 

9) 전기를 20분동안 100V로 흘려보낸다

 

10) 전기영동기를 끄고, holder를 꺼내어 UV광학기에 젤만 빼서 올려 보호커버를 덮고 UV를 켠 후, 형광띠를 확인한다.

 

 

 

[화공생명공학기초실험]염색체 DNA의 정제 및 분석 레포트