생화학실험 | Preparation of competent E-coil & transformation

 

 

 

TIP

 

 

DNA가 유전적 형질 전환을 한다는 것을 알아보기 위해서 Competent된 E-coli를 만든 후 transformation을 시킨다.

 

 

 

Competent cell

정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미한다. ligation을 마친 DNA나 circular 형태의 Plasmid를 증폭하기 위해서, 혹은 cloning을 끝내고 완성된 vector가 있는데 그것을 expression하기 위해서 E.coli에 transformation을 해야 합니다. 이때 사용하는 E.coli host cell을 competent cell이라고 부릅니다. 화학 처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러 가지가 있으며 이 중 가장 중요한 것은 calcium chloride이다.

 

Reagents : Calcium Chloride, Manganase Chloride, Hexamminecobalt Chloride, Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

 

다시말하면, E.coli를 포함한 대부분의 박테리아는 일반적인 환경에서 극히 제한된 양의 DNA(plasmid, phage)만을 받아들인다. 이러한 종류를 효과적으로 transformation(형질전환) 하기 위하여 박테리아는 DNA를 받아들이는 능력을 향상시키는 물리적, 화학적 형태의 처리가 필요하다. 정상적인 박테리아 cell에 이러한 물리적, 화학적 처리를 하여 외부의 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell을 competent cell이라 한다.

 

Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 CaCl₂로 처리하여 competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 된다. Heat shock을 가하면 plasmid 가 cell 안으로 들어가는 효율을 증가시킬 수 있다.

 

 

Transformation(형질전환)

외부 DNA를 host cell(숙주 세포) 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것이다. 모든 종의 세포에서 자연스럽게 일어나는 것이 아니고, DNA 흡수와 결합에 관련된 세포 표현 단백질인 수용성 요소를 가지고 있는 competent cell에서만 transformation 된다. E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl₂로 처리한 다음 잠시 heat shock 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다.

 

이와 같은 처리는 bacteria의 세포막이 DNA가 infection 될 수 있는 competent 상태로 일시적으로 유도되는 것으로 이때의 bacteria를 protoplast라고 한다. Pneumococcus에서 처음으로 발견된 이래 Streptococcus pneumoniase, Bacillus subtilis, B.stearothemophilus, Hasemophilus influenzae, Acinetobacter 등에서 널리 관찰되었습니다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) LB 5㎖에 BL21 cell 5㎕를 넣고, 37℃, 150rpm에서 Overnight culture.

 

2) LB 5㎖에 1)에서 키운 BL21 cell 5㎕를 넣고 37℃, 150rpm에서 1.5시간 동안 다시 배양(incubate).

 

3) 1.5㎖ Eppendorf tube에 2)를 1.5㎖씩 넣고, 10000rpm에서 1분간 centrifuge.

 

4) 상층액(supernatant)을 뽑아내고 50mM CaCl₂(cold) 1㎖를 넣고 조심스럽게 pipetting하여 cell을 깬다. (vortexing하면 cell이 stress를 받기 때문에 pipetting을 한다.)

 

5) Incubation in ice for 30mins.

 

6) 13000rpm 4℃ 5mins centrifuge 하여 상층액을 제거한다.

 

7) 50mM CaCl₂(cold)를 200㎕ 넣고 pipetting으로 cell을 풀어준다.

 

8) Plasmid를 8㎕ 넣는다.

 

9) 얼음에서 30분동안 방치한 다음 42℃에서 50초 처리 한다.

 

10) 얼음에서 2분간 방치한다.

 

11) LB 800㎕를 넣고 37℃ incubator에서 1시간 동안 배양 한다(without shaking).

 

12) 12,000rpm으로 1분 동안 centrifuge.

 

13) 상층액 중 600㎕ 버리고, pipetting하여 cell을 풀어주어 LB(Amp 100㎍/ml) plate에 50㎕ 뿌리고 spread.

 

14) 37℃ incubator에서 Overnight culture.

 

 

 

[생화학실험]Preparation of competent E-coil & transformation 레포트