생화학실험 | PCR과 전기영동

 

 

 

TIP

 

 

PCR은 아주 소량의 시료로도 우리가 원하는 DNA 서열을 엄청난 양과 높은 정확도로 증폭시킬 수 있다. 전기영동은 전하를 띤 분자화합물에 일정한 전압을 걸어주어 분자량, 전하량등의 물리화학적 성질의 차이에 따라 분리시키는 방법이다.

 

 

 

PCR 정의

PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)이란 DNA polymerase를 이용하여 원하는 부위의 DNA를 선택적으로 대량 복제 하는 방법이다. 1983년 PCR이 고안되어 적은 양으로 존재하는 DNA서열 탐지와 cloning이 가능하게 되었다. 방법은 표적 DNA서열의 증폭(amplification)에 기초를 두고 있다. 증폭하고자 하는 DNA내 표적 strand 3' 말단에 상보적인 두 개의 특정 oligonucleotide를 합성한 후에 oligonucleotide와 strand의 표적 DNA와 혼성화반응을 시킨다. 이때 oligonucleotide는 primer로 작용한다. oligonucleotide의 5’ 말단은 Taq polymerase에 의한 주형 strand의 증폭 시 개시 점으로 작용한다.

 

주형 strand가 복제된 후 그 복제산물들은 융해에 의해 변성되며, 반응물은 처음 주형 strand과 마찬가지로 primer가 annealing되도록 온도를 낮추고 또 다른 복제과정을 시작한다. 10분정도 소요되는 이 과정은 원하는 만큼 반복할 수 있다. 몇 번의 과정 후 대부분의 증폭산물은 주형DNA의 3’ 부위 사이의 절편이 증폭된 것이며 Taq polymerase는 각 라운드 후 사슬을 분리하기 위한 가열 단계에서도 불활성되지 않는 성질을 갖고 있기 때문에 이용된다. 증폭된 산물은 관심 있는 유전자를 탐지하거나 cloning하는데 이용될 수 있다. PCR기술 및 변형기술은 바이러스 DNA서열과 같은 드물게 존재하는 유전자를 동정하고, 하나의 세포로부터 분리한 매우 작은 양의 DNA를 recovery시키는데 이용된다. 분자량, 전하량등의 물리화학적 성질의 차이에 따라 분리시키는 방법이다.

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전기영동(Electrophoresis)

하전(荷電)된 이온, 고분자(단백질, 핵산 등), 입자 또는 세포 내 과립, 세포 등을 전해질용액 속에 넣고, 직류전압(直流電壓)을 걸어주면, 이들 물질이 하전과 반대부호의 극으로 영동(泳動)하는 현상. 물질의 분리수단으로 자주 이용된다. 영동매체나 그 목적에 따라 여과지전기영동법, 겔전기영동법, 존(zone)전기영동법, 등전점전기영동법, 등속전기영동법 등이 이용된다.

 

 

실험 방법

1. PCR

1) PCR tube에 2x premix (= PCR micture)를 10㎕넣는다

 

2) template를 1㎕ 넣는다

 

3) forward 와 reverse primer를 각각 1㎕씩 넣는다.

 

4) 3차 증류수를 7㎕ 넣는다.

 

5) tube를 sealing 한다. (증발하지 않도록 완벽히 뚜껑을 닫아줘야함)

 

6) PCR machine에 적정 온도를 셋팅하고 PCR을 시작한다.

 

2. 전기영동

1) Agarose gel 만들기

① 1X TAE(Tris + acetate + EDTA) buffer에 agarose powder를 1% 가 되도록 넣는다.

② 전자레인지를 이용해 agarose를 투명해 질 때 까지 완전히 녹여주고 틀에 부어 굳힌다.

 

2) Sample loading 하기

① gel 틀을 1X TAE buffer를 채운 전기영동 장치에 담근다.

② comb에 buffer가 차도록 해주며 comb에 가까운 방향이 (-)쪽으로 향하게 한다.

③ DNA sample에 dye를 섞어준다.

④ 첫 번째 comb에 marker를 loading 한다.

⑤ 이후로 DNA sample을 loading 한다.

⑥ 50-100V의 전압을 걸어준다.

 

 

 

[생화학실험]PCR과 전기영동 레포트